1 / 82

Transzdukció

Transzdukció. Bakteriofágok közvetítte genetikai információ csere Két fő bakteriofág típus Virulens fágok/lítikus fágok – fertőzik a sejtet, gyorsan szaporodnak, lizálják a sejtet

chesmu
Download Presentation

Transzdukció

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Transzdukció Bakteriofágok közvetítte genetikai információ csere Két fő bakteriofág típus Virulens fágok/lítikus fágok – fertőzik a sejtet, gyorsan szaporodnak, lizálják a sejtet Mérsékelt fágok/temperált fágok – fertőzik a sejtet, be tudnak épülni a genomba és profágként alvó állapotban – néha kivágódnak, szaporodnak és lizálják a sejtet

  2. Bakteriofágok morfológiája változatos RNS-t vagy DNS-t tartalmaznak fehérje burokban Szinte minden baktériumnak van fágja.

  3. A gazdabaktériumuk sejtjének felületén lévő specifikus receptorhoz kapcsolódnak Nukleinsavukat a gazda sejtbe injektálják Smithsonian (Oct 2000) T4 bakteriofágokegyE. coli sejt felületén

  4. Mérsékelt fág A gazda genomba épül be – félalvó állapot (a baktérium így lizogén bakt.) (pl. λbakteriofág)

  5. Fágkonverzió Az alvó profág – az integrálódott bakteriofág – a mikróba fenotípusát megváltoztató géneket hordoz - pl. a patogének és a toxin termelés toxin profág inzerciós hely (att site) Corynebacterium diptheriaea A fág génekről termelődik a toxin. Ez betegíti meg az embert. C.diptheriaea A fág nélkül a törzs nem termel toxint. Nem okoz diftériát.

  6. A fágfertőzés lizogén útvonala

  7. Transzdukció (specializált) • specializált transzdukció • LFT, kis frekvenciájú transzdukáló lizátum • HFT, nagy frekvenciájú transzdukáló lizátum • A specializált transzdukció  fág

  8. A specializált transzdukció egyszerű mechanizmusa

  9. Specializált transzdukció (Hibás kivágódás!!!)

  10. Specializált transzdukció •  fágnál (gal, bio markerek) • A profág pontatlan kivágódásával • A profág beépülése melletti gének is bejutnak a fágfejbe • Kis gyakoriságú jelenség • A hiba folytán kis valószínűséggel keletkeznek olyan fágok is, melyek hordoznak baktérium gént • LFT, kis gyakoriságú transzdukáló lizátum • Mivel a lambda fág fejmérete nagyobb, mint ami a fág DNS-hez szükséges méret (75%-109%) transzdukció esetén fág funkció sérülhet (defektív fág, minél nagyobb az átvitt bakterium DNS darab annál defektívebb a fág)

  11. Ha a fág defektív, helper fág kellhet a sikeres lizogénia kialakításához • A termelésnél nincs probléma, mert a jelenlévő intakt fág funkciók biztosítják a normális működést (többszörös genom ekvivalens) • Transzdukáló fággal lizogenizált baktérium is előfordul • Ugyanúgy indukálható, mint más lizogén • Ha defektív, akkor nem keletkezik fágrészecske • Ha a defektív funkciót teljes helper fággal kiegészítjük, indukció során az összes fágrészecske 50%-a transzdukáló HFT High frequency

  12. A virulens fágok egylépéses szaporodási görbéje - A latencia periódus alatt a fággenom replikálódik és a gazda genom teljesen leépül

  13. A fágfertőzés látható hatása a gazda DNS-re T4 fág DNS Fertőzés előtt Fertőzés után

  14. A fágfertőzés lítikus ciklusa

  15. Általános transzdukció (hibás pakolás!!!)

  16. Transzdukció • DNS átvitel baktérium sejtek között bakteriofág segítségével • Általános transzdukció • A transzdukáló fágrészecske csak bakteriális DNS-t hordoz • Pszeudovirion, mert a saját szaporodásához szükséges tulajdonságokat nem hordozza

  17. A fágok egy részénél fejméretű a pakolás, ami lehet hibás is – a pakoló mechanizmusnak nincs specifikus felismerő helye Így pakol a Salmonella typhimuriumP22 fágja és B. subtilis PBS1fágja

  18. Mi történik a recipiens sejteben?

  19. A baktériumok közötti géncsere hatékony módja a generalizált, vagy általánostranszdukció Hibás pakolás!!! Közeli genetikai bélyegek térképezése!

  20. Példa – transzdukió a Salmonella typhimuriumP22 fágjával P22 HT – hatékony általános transzdukáló - hanyag fág – a fágrészecskék 50%-ában gazda DNS, azaz transzdukáló részecske ( transducing particles = TP) Minden fejben (TP) 44 kb-nyiDNS – aSalmonella genom kb. 4400 kb nagyságú Ezért, ha a pakolás teljesen véletlenszerű, akkor 100 különböző fágrészecske a teljes genomot reprezentálhatja. 1011 P22 HT fág/ml szaporítható – tehát ebből 5 x 1010–ben gazda DNS van  1 ml-benkb. 5 x 108 Salmonella genomnyi (0.5)(1011fág/ml)/(100 TP [1 genom]) = 108genom kópia/ml alizátumban

  21. P1 fág • 100 kbp • Pac helytől fejméretű pakolás • DNS - Terminális redundancia, cirkuláris permutáció • Általános transzdukció

  22. MÁS FÁGOK • T4 (virulens) mutánsa • Lambda • Mu (transzpozon), DNS-e két végén gazda DNS

  23. Transzformáció • Pneumococcus (Stapylococcus) Bacillus transzformáció • Kompetencia • DNS felvétel/bejutás • Donor DNS megtartása a recipiensben • Más transzformációs rendszerek • Haemophilus influenzae • Escherichia coli • Elektroporáció • Protoplaszt transzformáció • Transzfekció – fág DNS-sel • E. coli • B. subtilis • Géntérképezés transzformációval

  24. Transzformáció • Genetikai információátvitel (az első amit felfedeztek) • Donor sejt nagyméretű DNS-t bocsájt ki • A DNS a tápközegben diffundál (a recipiens felé) • A DNS transzportálódik sejtfalon, sejtmembránon keresztül a citoplazmába, ahol rekombináció történik • Ez a transzformáció genetikai információátvitel, nem a normál sejtek tumorrá történő transzformációja (eukarióták esetén)

  25. Jelentősége? • Mivel a DNS könnyen degradálódik, azt gondolták nincs valós szerepe (csak a laboratóriumban) Ezzel szemben számos természetes genetikai transzformációs rendszer létezik: Achrobacter, AzotobacterBacillus, Butyvibrio, Campylobacter, Clostridium, Hemophilus, Micrococcus, Mycobacterium, Neiserria, Pseudomonas, • Streptococcus, Streptomyces, Synechoccus • Valamilyen jelentőségnek kell lennie • Kimutatták még: • Talajba jutattott plazmid és kromoszóma DNS fennmarad, mi több a Pseudomonas stutzeri és a Bacillus subtilis transzformálódik is • Egér > DNS etetés után kimutatható a DNS a vérben is, így lehet olyan sejt is , amelyik felveszi ( immunizálás )

  26. Transzformáció felfedezése és utóhatásai • Pneumococcus • Sima, poliszacharid burokkal rendelkező telep • patogén • Durva telep, kapszid poliszacharid hiánya • Nem patogén • Klasszikus transzformációs kísérlet • Avery kimutatja a transzformáló elv a DNS • Senki nem akarja elhinni • Hershey és Chase DNS és fehérje radioaktív jelölés (külön) • Watson és Crick, a DNS szerkezete • Pneuomococcus = Streptococcuspneumoniae • Bacillus subtilis 168

  27. Transzformáció • A transzformáció az a folyamat, amikor a sejtek „tiszta” DNS-t vesznek fel és építenek be. • Két fő típus • Természetes transzformáció (a mikróbáknak csak kis csoportja) • - általában lineáris DNS • 2. Mesterségesen indukált (a legtöbb, de nem az összes mikroorganizmus képes így DNS felvételre) • - általában plazmid DNS • Az a sejt, amelyik képes a DNS felvételére az kompetens.

  28. Mesterséges kompetencia A molekuláris biológia egyik legfontosabb, alapvető technikája, lehetőség, hogy idegen DNS-t vigyünk be a baktérium gazdába. Gyakran csak úgy érhető el, hogy mesterséges-kompetens sejteket készítünk. Az E. colifelvesz és replikál gyűrűs DNS-t. A mesterséges transzformáció két típusa: Kémiai kompetencia Elektroporáció/elektrotranszformáció, biolisztikus (génpuska) PROTOPLASZT PoliEtilénGlikol = PEG

  29. Kémiai kompetencia Néhány baktériumba, köztük az E. coli-ba, a kétértékű kationok, kis hőmérsékleten segítik a plazmid DNS felvételét ( a lineáris DNS-t is felveszik, de a citoplazma DNáz-ai gyorsan feldarabolják, még mielőtt bármit is tudna tenni) Nem teljesen világos, hogy hogyan is van. Felvételi csatornák: poliP, PHB, és Ca

  30. Nagy feszültség sokk Elektroporáció Nagy térerősség átmeneti lyukakat eredményez a sejtfalban Alkalmas körülmények között a DNS be/ki szivárog. A kinti nagy plazmid koncentráció gyors beáramlást eredményez. Elektroporációs küvetta Ide kerülnek a sejtek

  31. A transzformáció hatékonysága? Transzformációs gyakoriság Sejtszámra(transzformánsok száma/μg DNS) 106-109/μg pBR322 kb. 1011 plazmid/μg pBR322 úgy is mérhető, hogy a sejtek hány %-a kapott plazmidot DNS-re a DNS molekulák hány %-a transzformált sejtet

  32. Természetes kompetencia/transzformáció gram-pozitívokban Pl.: Streptococcus pneumoniae Bacillus subtilis -nem specifikus -korlátozott számú felvevőhely (30-75) -nick képződés -a komplementer szál degradálódik a felvétel közben -rekombináció a recipiensben

  33. Természetes transzformáció gram-negatív Pl.: Haemophilus influenzae Neisseriae gonorrhoeae -szekvencia specifikus -4-8 hely/sejt -nincs sejthez kötött intermedier -dsDNSimport a periplazmába -komplementer degradálódik a citoplazmába történő transzport során -rekombináció a recipiensben

  34. Gram-pozitív felvevő rendszer -jó gépezet a sejtekbe történő DNS szállításra a konjugációs rendszer fordítottja - néhány komponense a Tra funkciókhoz hasonlít

  35. Gram-negatív felvevő gépezet -ez se rossz - keresztezni kell a periplazmát és a külső membránt

  36. A folyamat energia ellátása? • Intracelluláris ATP hidrolízis • pH gradiens – PMF (proton motive force)? • komplementer degradáció • Funkciója • Tápanyag • DNS repair • Genetikaiidentitás/diverzitás

  37. Transzformáció • Kompetencia kialakulása • DNS kötődés és bejutás • A DNS integrációja a recipiens sejtben

  38. Kompetencia • Az alapelv nagyon hasonló (természetben előforduló) • Kompetencia = az a képesség, mellyel a DNS megkötésre kerül, ezáltal védett lesz a nukleázokkal szemben • A kompetencia időzítése különbözik • Szinte minden esetben (amit tanulmányoznak) fejlett szabályozás alatt áll a kompetencia

  39. A kompetencia fiziológiája • Meghatározott fiziológiai állapot • Valamely fejlődési szakaszhoz, vagy tápanyag ellátottsághoz kapcsolódik (legtöbbször, tápanyag hiány kialakulása kapcsolja be) • B. subtilis esetében hőmérséklet csökkenés is kiválthatja (42°C>37°C) • A szabályozó rendszerben olyan represszorok vannak, melyek • egyrészt flagella és kemotaxis géneket • másrészt kompetencia géneket aktiválnak

  40. Kivételek • Bakteriofág is indukálhat kompetenciát (Staphylococcus aureus) • Exponenciális növekedési szakaszban alakul ki a kompetencia (S. pneumoniae) • Antibiotikumok hatására, szubletális koncentráció • A tenyészetben lévő kompetens sejtek száma változó (15% Bacillus-Streptococcus, 100%) • A kompetencia kialakulása függ a sejtszámtól (sejtsűrüség faktorok, peptidek)

  41. Kompetencia kialakulása rövid ideig tart (pár perc) • Stacioner fázisban • Bacillusoknál, ha a kétszereződési idő 150-390 perc • Mivel kemosztát kultúrában is van kompetencia, de nincs sporuláció, ezért a sporuláció nem szükségszerűen kapcsolódik a kompetenciához • Hasonlóan a korai sporulációs génekben mutáns baktérium kompetens

  42. A B subtilis kompetens sejtek: • Kisebb sűrűségűek (gradiens centrifugálással elkülöníthetők a normál sejtektől) • Kisméretűek • Egy nem replikálódó genomja van • A kompetens sejtek membránja 4* több PHB-t (polihidroxi-butirát) tartalmaz, (egyébként raktározó szerepe van) • Segít egy transzmembrán csatornát kialakítani

  43. S. penumoniae • Kompetens sejtek membránján kompetencia faktor • Ez a közegbe is kikerül • Ettől a nem kompetens sejtek kompetenssé válnak, úgy hogy a kompetencia faktor egy másik membrán fehérjéhez köt (comD terméke) • A kompetencia faktor kötésével legalább 10 fehérje kezd el szintetizálódni • A kompetencia faktor megmagyarázza, miért kell nagy sejtsűrűség, nagyobb a valószínűsége, hogy megtalálja a receptorát • A com lókusz mutációi megakadályozzák a kompetencia kialakulását

  44. comA terméke hasonlít az ATP függő transzport fehérjékhez (melyek toxin fehérjéket szállítanak a sejt felszínére, coli hemolizin gén) • A kompetencia kialakulásával a sejtfal porózusabbá válik • Az autolitikus enzimaktivitás növekszik • Baktérium sejtek láncolata hosszabb lesz • A legtöbb változás a sejt egyenlítői síkjában következik be, ahol a növekedés történik, és ahol a DNS felvétel történik

  45. DNS kötés • Kompetens és nem kompetens sejt is köt DNS-t • A nem kompetens sejtben lemosható a DNS, a kompetens sejtben nem mosható le egyszerűen • EDTA hatására a DNS megkötődik, de minden további feldolgozás megáll • Kb. 50 DNS kötő hely van a kompetens B. subtilis felszínén • A kötött DNS érzékeny a nukleázokra és a nyíróerőkre • Bármilyen eredetű DNS kötődhet • Minimum 500 bp hosszú fragmens kell a kötéshez • Egyszálú, glükozilált DNS, ds RNS, RNS-DNS hibrid nem kötődik

  46. DNS bejutás • A következő lépés a DNS bejutása a sejtbe • A 3’ végtől kezdve • A bejutás előtt a kötőhely melletti endonukleázok megfelelő méretre hasítják a DNS-t • Véletlenszerű hasítás • Eredmény 15 kb-nál nem nagyobb DNS fragmensek (kisebb, mint amekkorát a transzdukáló fágok bejuttatnak) • Az endonukleázoknak magnéziumra vagy kalciumra van szükség (ezért érzékeny az EDTA-ra) • Ebben a fázisban, ha szétválasztjuk a DNS-t és a sejteket a kettős szálú DNS alkalmas a transzformációra

  47. Következő lépés az eklipsz komplex kialakulása • A DNS kötődik egy kompetencia specifikus fehérjéhez • Ezáltal a DNS egyszálú lesz • Védett lesz a külső nukleáz hasítással szemben • Teljesen véletlenszerű, hogy melyik szál hasad le és az is, hogy milyen helynél kezdődik a hasítás • A lebomlott szál nukleotidjai a médiumba kerülnek

More Related