Βρουκέλλωση Νικόλαος Κ. Γατσέλης Παθολογική Κλινική

1. Βρουκέλλωση Νικόλαος Κ. Γατσέλης Παθολογική Κλινική & Ομώνυμο Ερευνητικό Εργαστήριο Πανεπιστημίου Θεσσαλίας

3. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ • Πέμπτη πληγή του Φαραώ • Βαριά επιδημία έπληξε όλα τα κοπάδια των Αιγυπτίων, ώστε «κάθε είδους ζωντανά της Αιγύπτου άρχισαν να ψοφούν» (εδ. 9:1-7) • 1861, J.A. Martson:περιέγραψε για πρώτη φορά τα συμπτώματα της νόσου στον άνθρωπο • 1887, D. Bruce:απομόνωσε τις βρουκέλλες από τους σπλήνες των νεκρών στρατιωτώνστη Μάλτα • 1897, Wright & Smith:ανίχνευσαν Abs κατά της B. melitensis σε ορό μολυσμένων ανθρώπων & ζώων • 1905, Zammit et al:απομόνωσαν τη βρουκέλλα στο γάλα μολυσμένων ζώων • 1919: το μικρόβιο ονομάστηκε βρουκέλλα (μέχρι τότε η νόσος ήταν γνωστή ως πυρετός της Μάλτας, της Μεσογείου, της Κύπρου, της Νάπολι, του Γιβραλτάρ, της Κριμαίας, της Βαρκελώνης, «κυματοειδής πυρετός», «μελιταίος πυρετός»)

4. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ • μικρά, Gm (-), μη σπορογόνα βακτηρίδια, χωρίς έλυτρο • in vivo συμπεριφέρονται ως ενδοκυττάρια παράσιτα • ευαίσθητα στο ηλιακό φως και την ιονίζουσα ακτινοβολία • καταστρέφονται με το βρασμό και την παστερίωση • ανθεκτικά στην ξήρανση και την κατάψυξη • παράγουν ουρεάση που τις προστατεύει από το όξινο pH του στομάχου

5. The changing Brucella ecology: novel reservoirs, new threats Pappas, IJAA 2010. Moreno, Front Microbiol 2014

6. ΔΙΑΧΡΟΝΙΚΗ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΔΗΛΟΥΜΕΝΗΣ ΕΠΙΠΤΩΣΗΣ ΤΗΣ ΒΡΟΥΚΕΛΛΩΣΗΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ 2000 – 2009 http://www.keelpno.gr/Portals/0/Αρχεία/Ζωονόσοι/Βρουκέλλωση/broukellosi%2005-09.pdf

7. ΜΕΣΗ ΕΤΗΣΙΑ ΔΗΛΟΥΜΕΝΗ ΕΠΙΠΤΩΣΗ (ΚΡΟΥΣΜΑΤΑ/100000 ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ) ΤΗΣ ΒΡΟΥΚΕΛΛΩΣΗΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ ΑΝΑ ΦΥΛΟ ΚΑΙ ΗΛΙΚΙΑΚΗ ΟΜΑΔΑ 2005 – 2009 http://www.keelpno.gr/Portals/0/Αρχεία/Ζωονόσοι/Βρουκέλλωση/broukellosi%2005-09.pdf

8. ΕΠΟΧΙΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ 2005 – 2009 http://www.keelpno.gr/Portals/0/Αρχεία/Ζωονόσοι/Βρουκέλλωση/broukellosi%2005-09.pdf

9. ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ (2005 – 2009) • 65% επαφή με αγροτικά ζώα • 59% κατανάλωση απαστερίωτων γαλακτοκομικών • 62% ενασχόληση με επάγγελμα υψηλού κινδύνου • 45% κτηνοτρόφοι http://www.keelpno.gr/Portals/0/Αρχεία/Ζωονόσοι/Βρουκέλλωση/broukellosi%2005-09.pdf

10. ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ • ΜΕΣΗ ΕΤΗΣΙΑ ΔΗΛΟΥΜΕΝΗ ΕΠΙΠΤΩΣΗ • Ελλάδα: 2.2/100000 • Θεσσαλία: 9.6/100000 • Ανατολική Μακεδονία & Θράκη: 7.8/100000 • Νότιο Αιγαίο: 0.3/100000 • Κρήτη: 0.4/100000 http://www.keelpno.gr/Portals/0/Αρχεία/Ζωονόσοι/Βρουκέλλωση/broukellosi%2005-09.pdf

11. ΜΕΤΑΔΟΣΗ Κατάποση μολυσμένων μη παστεριωμένων γαλακτοκομικών (γάλα, τυρί, βούτυρο, παγωτά) αλλά και βρώση ήπατος – σπλήνα μολυσμένων ζώων Άμεση επαφή με μολυσμένα ζώα (π.χ. πλακούντας) διαμέσου αμυχών δέρματος & βλεννογόνων Εισπνοή μολυσμένων αεροσωματιδίων (εργαζόμενοι σε εργαστήρια) Επαγγελματική νόσος κτηνοτρόφοι, σφαγείς, κτηνίατροι, εργάτες σε βιομηχανίες γαλακτοκομικών, εργαζόμενοι σε μικροβιολογικά εργαστήρια Moreno, Front Microbiol 2014. Pappas, NEJM 2005

12. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ • Μικρός αριθμός μικροβίων (10 βρουκέλλες) μπορούν να προκαλέσουν λοίμωξη • Χρόνος επώασης: 7 ημέρες έως 3 μήνες • Λεμφοκύτταρα προσβεβλημένων ιστών – επιχώριοι λεμφαδένες – δικτυοενδοθηλιακό σύστημα • Ο οργανισμός αντιδρά με τη δημιουργία κοκκιωμάτων • Μετά την είσοδό τους καταστρέφονται ενδοκυττάρια με την επίδραση των λυσοσωμάτων • 15-30% των μικροοργανισμών επιβιώνουν και πολλαπλασιάζονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο Goerghiou, Lancet 1991. Guzman-Verri, ProcNatlAcadSci USA 2002. Arenas, Infect Immun 2000.Manterola, J Bacteriol 2005.

13. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ Production of Th2 cytokines (IL-10, IL-13) and TGFb1 Low frequency of IL- 2Ra positive Th-cells down modulation of antigen presentation diminished production of IL-2 & IFN-γ inhibition of phagolysosome function interfere with IFNγ signaling interfere with TLR signaling blockade of TNFα & IL-12 production Prevention of apoptosis Deficient NK cytotoxicity SKendros, Microbes Infect 2011.

14. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Βρουκέλλα ο μεγάλος μιμητής Moreno, Front Microbiol 2014.

15. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Οστεοαρθρικές εκδηλώσεις • Η πιο συχνή εντοπισμένη μορφή (~20%) • Ιερολαγονίτιδα(54%) • συνήθως στα νεαρά άτομα • Περιφερική αρθρίτιδα (33%) • γόνατα, ισχία, αγκώνες, ΠΧΚ,ΠΔΚ • προσθετικές αρθρώσεις • αντιδραστική αρθρίτιδα • Σπονδυλίτιδα (10%) • οσφυικοί και κατώτεροι θωρακικοίσπόνδυλοι • πολλαπλές εντοπίσεις (9-30%) • παρασπονδυλικά ± επισκληρίδια αποστήματα (21-42%) • δυσκολία στη θεραπεία και πρόκληση αναπηρίας • MRI η εξέταση εκλογής Pappas, NEJM 2005. Aygen, Med Mal Infect 2002. Raptopoulou, Clin Imaging 2006. Solera, Clin Infect Dis 1999. Ugarriza, Br J Neurosurg 2005.

16. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Ουροποιογεννητικό σύστημα Ορχεοεπιδιδυμίτιδα (1.6-20%) Προσβολή πλακούντα – αυτόματες εκτρώσεις Σπάνια: υδροκήλη, πυελονεφρίτιδα, σαλπιγγίτιδα, πυελικά αποστήματα & προστατικό απόστημα Mantur, Indian J Med Microbiol 2007. Navarro-Martinez, Clin Infect Dis 2001. Khan, Clin Infect Dis 2001.

17. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Προσβολή του ήπατος • Τρανσαμινασαιμία, η πιο συχνή εκδήλωση (25%) • Σπάνια: ηπατικό απόστημα, ίκτερος, χολοκυστίτιδα, ασκιτική συλλογή, περιτονίτιδα • Ιστολογικά: κοκκιωματώδης νόσος Ariza, Clin Infect Dis 2001. Cervantes, Postgrad Med J 1982. AkritidisScand J Gastroenterol 2001. Akritidis, ClinGastroenterolHepatol 2007.

18. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Νευροβρουκέλλωση • 5-7% των ασθενών • Δυσμενής πρόγνωση (θνητότητα 8.3%) • Μηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα, μηνιγγοεγκεφαλίτιδα • Προσβολή εγκεφαλικών συζυγιών (VI, VIII) • Αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια • Σπάνια: εγκεφαλικό απόστημα, αγγειίτιδα, απομυελινωτική νόσος, ανευρύσματα, ψυχιατρικές εκδηλώσεις, υδροκέφαλος • Αυχενική δυσκαμψία <50% • MRI: μη ειδικά ευρήματα • ΕΝΥ: πλειοκυττάρωση, ↑ πρωτεΐνη, ↓ σάκχαρο • Θετικές καλλιέργειες ΕΝΥ μόνο στο 20% • Έλεγχος αντισωμάτων στο ΕΝΥ (συγκολλητινοαντιδράσεις – ELISA) • Αποκλεισμός φυματιώδους μηνιγγίτιδας • Θετική PCR Shakir, Brain 1989. Mantur, J Med Microbiol 2006.Gul, Int J Infect 2009. Al-Sous, AJNR 2004.

19. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Ενδοκαρδίτιδα • Σπάνια <1% • Το κύριο αίτιο θνητότητας • Συνήθως προσβάλλεται η αορτική βαλβίδα • Απαιτείται άμεση χειρουργική επέμβαση • Άλλες εκδηλώσεις: σχηματισμός ανευρυσμάτων, ενδαρτηρίτιδα, συνοδά περικαρδίτιδα/μυοκαρδίτιδα Reguera, Eur J ClinMicrobiol Infect Dis 2003.Sasmazel, Ann ThoracSurg 2010.

20. Α Β

21. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Προσβολή του αναπνευστικού • 7% των ασθενών • Βήχας, δύσπνοια, θωρακαλγία • Βρογχίτιδα, Πνευμονία, Πλευριτική συλλογή, Εμπύημα, απόστημα, πυλαία ή παραπυλαία λεμφαδενοπάθεια, Διάμεση πνευμονίτιδα • Πλευριτικό υγρό: πλειοκυττάρωση με λεμφοκυτταρικό τύπο, ↑ πρωτεΐνη, ↑ADA • Δ.Δ.:TBC, σαρκοείδωση Pappas, Clin Infect Dis 2003.

22. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Προσβολή του αναπνευστικού Zachou, Occup Med (Lond) 2008.

23. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Δερματολογικές εκδηλώσεις • Επίπτωση 1-14% • Συνήθως σε ασθενείς με επαγγελματική έκθεση • Μη ειδικό κηλιδοβλατιδώδες εξάνθημα, φυσαλίδες, οζώδες ερύθημα, • Δερματικά έλκη, αποστήματα, λεμφαγγειίτιδα (B. suis), σ. Stevens-Johnson Pappas, Clin Infect Dis 2003. Metin, Int J Dermatol 2001. Akcali, AdvTher 2007. Ariza et al, Arch Dermatol 1989. Karaali, Indian J Dermatol 2011.

24. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ – Οφθαλμική προσβολή • Ραγοειδίτιδα, επιπεφυκίτιδα, χοριοειδίτιδα, κερατίτιδα, οίδημα οπτικής θηλής, αιμορραγία αμφιβληστροειδούς • Μηχανισμοί: άμεση προβολή, σηπτικά έμβολα, ανοσοσυμπλέγματα Rolando, Clin Infect Dis 2008.

25. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ • Αναιμία 44-74% • Λευκοπενίαμε σχετική λεμφοκυττάρωση • Λευκοκυττάρωση (9%) στις εντοπισμένες μορφές • Αναιμία • Θρομβοπενία (10%) • Αιμοφαγοκυτταρικό σύνδρομο Dilek, Turk J Med Sci 2008. Burantas, Ann Pharmacother 2010.

26. ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ • Στο 5-15% των ασθενών • Συνήθως (90%) στο πρώτο έτος από τη μόλυνση • Ηπιότερη κλινική εικόνα σε σχέση με το πρώτο επεισόδιο • Αντιμετωπίζονται με επανάληψη του αντιβιοτικού σχήματος • Συνήθως οφείλονται σε ατελή θεραπεία και όχι αντίσταση στα αντιβιοτικά Pappas, Clin Infect Dis 2003. Ariza, Clin Infect Dis 2005.

27. ΔΙΑΓΝΩΣΗ - Καλλιέργειες • Χρυσός κανόνας στη διάγνωση: απομόνωση του βακτηρίου από το αίμα ή τους προσβεβλημένους ιστούς • Ευαισθησία των καλλιεργειών ποικίλλει (15-70%) • Υψηλότερες αποδόσεις με τα νεότερα αυτοματοποιημένα συστήματα (Bactec, BacAlert) • Παρατεταμένη καλλιέργεια > 3 εβδομάδες • Καλλιέργειες μυελού: • υψηλότερη απόδοση κατά 15-30% • Λήψη κ/ων κατά τη φάση του πυρετού • αυξάνει την ευαισθησία λόγω της πιθανής • βακτηριαιμίας Memish, J Infect 2000. Bannatyne, J ClinMicrobiol 1997. Yapupsky, J ClinMicrobiol 1999. Gotuzzo, J Infect Dis 1986.Kadanali, Infection 2009.

28. ΔΙΑΓΝΩΣΗ – Ορολογικός έλεγχος • Rose Begal • εναιώρημα από κύτταρα B. abortusσυνδεδεμένα με χρωστική • εύκολη και ταχεία μέθοδος (screening test) • υψηλή ευαισθησία (99%) • χαμηλή ειδικότητα (^^^ ψευδώς αρνητικά) • τα θετικά ευρήματα χρειάζονται επιβεβαίωση με συγκολλητινοαντιδράσεις Araj, Int J Antimicrob Agents 2010. Pappas, Clin Infect Dis 2003. Dakouko, Expert Rev Anti Infect Ther2011. Lopez, ClinMicrobiol Infect 2005.

29. ΔΙΑΓΝΩΣΗ – Ορολογικός έλεγχος • Συγκολλητινοαντίδραση Wright • ανιχνεύει αντισώματα (IgG+IgM+IgA)κατά του s-LPS • διασταυρούμενη αντίδραση: Yersinia enterocolitica O:9, Escherichia hermanni, Escherichia coli O:157, Salmonella O:30, Stenotrophomonasmaltophila, Vibrio cholerae O:1, Francisellatularensis, Xanthomonasmaltophilia, Afipiaclevelandensis • θετικός τίτλος ≧1/80 (σε ενδημικές περιοχές ≧1/160) • ψευδώς αρνητική στα αρχικά στάδια της νόσου • «φαινόμενο «προζώνης»: ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα Araj, Int J Antimicrob Agents 2010. Pappas, Clin Infect Dis 2003. Dakouko, Expert Rev Anti Infect Ther2011. Nielsen, Vet Microbiol 2004.

30. ΔΙΑΓΝΩΣΗ – Ορολογικός έλεγχος • Αντίδραση Wright Coombs • Ανίχνευση αντισωμάτων τα οποία δεν προκαλούν συγκόλληση (incomplete or non-agglutinating Abs) • Ανοσοδεσμευτική τεχνική – Brucellacapt • Παρόμοια αποτελέσματα • Πιο εύχρηστη Araj, Int J Antimicrob Agents 2010. Pappas, Clin Infect Dis 2003.Dakouko, Expert Rev Anti Infect Ther2011. Nielsen, Vet Microbiol 2004.Mantecon Vallejo, EnfermInfeccMicrobiolClin 2004

31. ΔΙΑΓΝΩΣΗ – Ορολογικός έλεγχος • Ειδικά αντισώματα (ELISA) • ανίχνευση ολικών ή και μεμονωμένων IgM, IgG, IgA έναντι κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών • πιο ευαίσθητη μέθοδος σε χρόνιες περιπτώσεις βρουκέλλωσης • πιο ακριβή μέθοδος συγκριτικά με τις συγκολλητινοαντιδράσεις • μειωμένη αξία στην παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία λόγω της παραμονής υψηλών τίτλων για μακρό χρονικό διάστημα • δεν μπορούν να διακρίνουν ενεργό λοίμωξη από παρελθούσα λοίμωξη • χαμηλή ευαισθησία IgM στη διάγνωση οξείας λοίμωξης Araj, Epidemiol Infect 1988. Pappas, Clin Infect Dis 2003. Dakouko, Expert Rev Anti Infect Ther2011. Gomez, Clin Vaccine Immunol 2008.

32. ΔΙΑΓΝΩΣΗ – PCR • Στόχος:16S rRNA, outer membrane protein (omp2a, omp2b), 23S rRNA, IS711, BCSP31 Araj, Int J Antimicrob Agents 2010. Romero, J ClinMicrobiol 1995. Navarro, FEMS Immunol Med Microbiol 2002. Navarro, Expert Rev MolDiagn 2004. Navarro, CID 2006. Queipo-Ortuno, ClinMicrobiol Infect 2005.Nimri, BMC Infect Dis 2003.

33. ΔΙΑΓΝΩΣΗ – PCR • Χρειάζεται τυποποίηση της μεθόδου σε εξειδικευμένα εργαστήρια • Ευαισθησία 50-100% & Ειδικότητα 60-98% • Πλεονεκτούν στην περίπτωση υποτροπής / θεραπευτικής αποτυχίας • Ερμηνεία του θετικού αποτελέσματος;;; Araj, Int J Antimicrob Agents 2010. Romero, J ClinMicrobiol 1995. Navarro, FEMS Immunol Med Microbiol 2002. Navarro, Expert Rev MolDiagn 2004. Navarro, CID 2006. Queipo-Ortuno, ClinMicrobiol Infect 2005.Nimri, BMC Infect Dis 2003.

34. ΘΕΡΑΠΕΙΑ – Βασικές αρχές • Αντιβιοτικά που διεισδύουν στα μακροφάγα και δρουν σε όξινο ενδοκυττάριο περιβάλλον • Απαιτείται συνδυασμός θεραπείας • Σημαντικός ο ρόλος των αμινογλυκοσιδών • Χρόνος θεραπείας δεν πρέπει να είναι μικρότερος των 6 εβδομάδων • Συμμόρφωση του ασθενούς Solera, Clin Infect Dis 2004. Pappas, Expert OpinPharmacother 2005.

35. ΘΕΡΑΠΕΙΑ – WHO 1986 • Doxycycline p.o. 100mg bid (6 weeks) • + • Rifampicin p.o. 600-900 mg qd (6 weeks) • Doxycycline p.o. 100mg bid (6 weeks) • + • Streptomycin i.m. 1 gr (2-3 weeks) WHO, 1986. Pappas, Int J Antimicrob Agents 2005.

36. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Rifampicin vs Doxycycline – Streptomycin ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΠΟΤΥΧΙΑ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

37. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Rifampicin vs Doxycycline – Streptomycin ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

38. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Rifampicin vs Doxycycline – Streptomycin ΠΑΡΕΝΕΡΓΕΙΕΣ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

39. ΘΕΡΑΠΕΙA – Ποια είναι η επιλογή των ιατρών; Pappas, J Infect 2007.

40. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Rifampicin vs Quinolones – Rifampicin ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΠΟΤΥΧΙΑ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

41. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Rifampicin vs Quinolones – Rifampicin ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

42. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Streptomycin vs Quinolones – Rifampicin ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΠΟΤΥΧΙΑ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

43. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Streptomycin vs Quinolones – Rifampicin ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

44. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Streptomycin vs Doxycycline – Quinolones ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΠΟΤΥΧΙΑ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

45. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Streptomycin vs Quinolones – Rifampicin ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

46. ΘΕΡΑΠΕΙA – Κόστος φαρμάκων 2-3 x Villa, 2010

47. ΘΕΡΑΠΕΙA – IOANNINA RECOMMENDATIONS (2006) Ariza, Plos One 2007

48. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Streptomycin vs Doxycycline – Gentamycin ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΠΟΤΥΧΙΑ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

49. ΘΕΡΑΠΕΙA Doxycycline – Streptomycin vs Doxycycline – Gentamycin ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ Yousefi-Noorale, Cohrane Database Syst Rev 2012

50. ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΔΥΣΜΕΝΕΙΣ ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ • χρήση λιγότερου αποτελεσματικού αντιβιοτικού σχήματος • άρρεν φύλο • αιμοπετάλια <150000 /ml • διάρκεια συμπτωμάτων <10 ημέρες από την έναρξη της θεραπείας • θετικές καλλιέργειες αίματος κατά την έναρξη της θεραπείας • πυρετός >38.3οC Κίνδυνος υποτροπής εντός 12μήνου Χαμηλός 4.5% Μέτριος 32% Υψηλός 67% Ariza, Clin Infect Dis 1995. Solera, J Infect 1998.