Использование NGS в анализе транскриптомов бактерий на примере микобактерий

1. Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Лаборатория структуры и функций генов человека Использование NGS в анализе транскриптомов бактерий на примере микобактерий Тимофей Скворцов Москва 2013

2. I. Бактериальный транскриптом и NGS

3. Бактериальный транскриптом Содержание основных классов РНК в транскриптоме Размер генома типичной бактерии: ≈5 млн п.о. Масса РНК в одной бактериальной клетке: ≈0.1-0.2 пг

4. Сложность бактериального транскриптома транс-малые РНК цис-малые РНК (Toledo-Arana and Solana, 2010, Bioessays)

5. Сложность бактериального транскриптома Рибопереключатели Длинные НТО Перекрывающиеся НТО Безлидерные РНК (Toledo-Arana and Solana, 2010, Bioessays) (Guell et al., 2011, Nat Rev Microbiol)

6. Сложность бактериального транскриптома Влияние хроматина и структуры нуклеоидов на регуляцию транскрипции Альтернативная транскрипция Эпигенетические модификации Локализованная трансляция Сплайсинг РНК Полиаденилирование РНК Редактирование РНК Процессинг РНК (Guell et al., 2011, Nat Rev Microbiol)

7. Упрощенная схема анализа транксриптома бактерий Пробоподготовкаи секвенирование Выделение РНК Синтез кДНК @read1 GCATGATCGTA + 9:;<=>?@ABC РНК Данные NGS Бактерии кДНК • Культура • In vivo/in planta • Некультивированные образцы • Обогащение • Фракционирование • Фрагментирование • Модификации • Амплификация • Модификации • Фракционирование • Платформа • Мультиплексирование • Paired end/Single end sequencing

8. Схема анализаданных NGS FASTQ file(s) Контроль качества FASTQC Фильтрация ридов Удаление адаптерных последовательностей FASTX toolkit reference genome FASTA file Bowtie, BWA, SOAP, Tophat etc. IGV, Artemis Картирование ридов Визуализация SAM/BAM file(s) Фильтрация Дедупликация SAMtools, Picard tools Качественный анализ Различные программы edgeR, DESeq, bayseqetc. Количественный анализ GTF/GFF/BED file(s) GOSeq, GSEA, DAVID etc. Gene set enrichment анализ

9. Бактериальный транскриптом Выявление функциональных особенностей генома (Sorek and Cossart, 2010, Nat Rev Genet)

10. Бактериальный транскриптом Поиск дифференциально экспрессирующихся генов Нормализация: RPKM/FPKM,TMM etc. Сравнение: edgeR, DESeq, DEGSeq, bayseq, NOISeq etc. Условие 1 Условие 2 Ген 1 Ген 2 Ген 3

11. II. Качественное описание бактериального транскриптома на примере Mycobacterium avium

12. Mycobacterium avium Согласно современной таксономической классификации, род Mycobacteriumвключает более 60 видов и более 100 подвидов. Mycobacterium avium Условно-патогенные микобактерии. Вызывают диссеминированные инфекции у людей с иммунодефицитами. Возможно вызывает болезнь Крона. Mycobacterium avium paratuberculosis вызывают болезнь Джонса у жвачных животных. Mycobacterium avium внутри макрофагов

13. Новые малые РНКMycobacterium avium Положение sRNA-кандидатов в геноме Нами были обнаружены 4 кандидатных малых РНК Mycobacterium avium, 3 из них были гомологичны уже известным малым РНК M. tuberculosis. MAV_1034-1035 не имеет гомологии в геноме M.tuberculosis и обладает стабильной вторичной структурой (RNAfold). (Ignatov et al. 2010)

14. Mycobacterium avium – транскриптом in vitro Мы провели RNA-seq (Illumina) транскриптома M. avium subsp. avium TMC724 из культуральной среды в mid-log фазе клеточного роста. Было получено ≈42 млнридов, 28.2 млн ридов было картировано на геном M. avium. (Ignatov et al., unpublished results)

15. Mycobacterium avium – транскриптом in vitro • Для 844 генов были определены точки старта транскрипции (TSS), для 652 из них в 5-8 п.о. upstream от TSS были найдены консенсусные промотерные последовательности. Точки старта транскрипции (TSS) • 33% из предполагаемых TSS были картированы в ±3 п.о. от старт-кодонов соответствующих генов, что говорит в пользу того, что их мРНК являютсябезлидерными. • Для остальных генов 5’-НТОбыли от 3 до 728 п.о.в длину, среднее значение – 83 п.о.6 из этих генов имели в составе 5’-НТО рибопереключатели, из них 3 – лидерные последовательности ykok, Mg2+-сенсоров, контролирующих экспрессию белков-транспортеров ионов магния. Визуализация картирования ридов на геном (Artemis) (Ignatov et al., unpublished results)

16. Mycobacterium avium – транскриптом in vitro Антисмысловая транскрипция • Нами было выявлено 86кандидатных антисмысловых РНК, протяженностью от одного до нескольких генов. • Также было обнаружено 10кандидатных транс-малых РНК, 4 из которых не имели гомологии с геномом M. tuberculosis.Малая РНК MAV_1034-1035 представляет особый интерес для дальнейшего изучения, т.к. обладает высоким уровнем экспрессии и не имеет гомологии с геномомM.tuberculosis. (Ignatov et al., unpublished results)

17. III. Сравнительный анализ транскриптомов бактерий на примере Mycobacterium tuberculosis

18. Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Патогенные микобактерии, возбудители туберкулеза. Примерно 30% населения Земли инфицировано M. tuberculosis. Туберкулез уносит каждый год около 1.5 млн человеческих жизней (больше, чем рак легкого). Mycobacterium tuberculosis

19. Mycobacterium tuberculosis – дормантное состояние Активные MTB Овоидные формы MTB (По Chao and Rubin, 2010, Annu Rev Microbiol) (Shleevaet al., 2011, Tuberculosis)

20. Поиск дифференциально экспрессирующихся генов Мы провели сравнение транскриптомов M. tuberculosis H37Rv в дормантном состоянии (Dorm) и логарифмической фазе роста (Log). Секвенирование проводилось на платформе Illumina, в биологических трипликатах. (Ignatov et al., unpublished results)

21. Поиск дифференциально экспрессирующихся генов Вычисление корреляции между репликатами. Мы вычислили корреляционный коэффициент Спирмена для выявления сходимости репликатов. Сходимость результатов внутри групп была высокой (до 0,99) и превышала межгрупповую.Для антисмысловых транскриптов (AS) сходимость была ниже, тем не менее оставаясь значимой. (Ignatov et al., unpublished results)

22. Поиск дифференциально экспрессирующихся генов Top 30 генов с повышенной экспрессией при переходе в Dorm Мы применили программу edgeR для поиска генов, чья относительная представленность транскриптов которых внутри каждого из транскриптомов увеличилась/уменьшилась. 890 генов увеличает экспрессию при переходе в дормантное состояние (Dorm), при это снижается экспрессия 939 генов (Ignatov et al., unpublished results)

23. Поиск дифференциально экспрессирующихся генов Анализ категорий генной онтологии (Gene Ontology, GO) и представленности генов (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) был предпринят при помощи программы GOseq. Обогащено в Dorm Обогащено в Log (Ignatov et al., unpublished results)

24. IV. Перспективы транскриптомики бактерий

25. Перспективные направления РНК-белковые взаимодействия Вторичная структура РНК Модификации РНК Альтернативная транскрипция (Guell et al., 2011, Nat Rev Microbiol)

26. Перспективные направления Пространственная организация (локализомика) Секвенирование транскриптома одной клетки (Campos and Jacobs-Wagner, 2013, Curr Opin Microbiol) (Guell et al., 2011, Nat Rev Microbiol) (Raj and van Oudenaarden, 2008, Cell)

27. Наш коллектив

28. Спасибо за внимание

29. Сложность бактериального транскриптома

30. Сложность бактериального транскриптома

31. Сложность бактериального транскриптома Малые РНК бактерий

32. Сложность бактериального транскриптома

33. Инфекционный цикл туберкулеза Излечение Латентная инфекция≈2 000 000 000 человек Трансмиссия Смерть ≈2 000 000 случаев в год Стерилизация инфекции Активный туберкулез(вероятность – 10% в течение жизни) ≈10 000 000 случаев в год

34. Mycobacterium avium – транскриптом in vitro (Ignatov et al., unpublished results)

35. Схема анализа

36. Новые малые РНКMycobacterium avium Положение sRNA-кандидатов в геноме Нами были обнаружены 4 кандидатных малых РНК Mycobacterium avium, 3 из них были гомологичны уже известным малым РНК M. tuberculosis. MAV_1034-1035 не имеет гомологии в геноме M.tuberculosis и обладает стабильной вторичной структурой (RNAfold). (Ignatov et al. 2010)

37. Поиск дифференциально экспрессирующихся генов В Dorm клетках содержится в ≈100 раз меньше мРНК, чем в Log. Мы применили программу edgeR для поиска генов, чья относительная представленность внутри каждого из транскриптомов увеличилась/уменьшилась. (Loven et al., 2012, Cell)