Таргетная нанотерапия глиом

1. Таргетная нанотерапия глиом Всероссийский конкурс инновационных проектов 2011 Нуколова Наталия Владимировна Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского Российский национальныйисследовательскиймедицинский университетимени Н. И. Пирогова

2. Мультиформная глиобластома • В структуре нейроонкологических заболеваний 40-45 % принадлежит низкодифференцированным глиомам. • Самая злокачественная из них — мультиформная глиобластома характеризуется быстрым неконтролируемым ростом, высокой частотой послеоперационных рецидивов. • Cредняя выживаемость пациентов с глиобластомой составляет около года с момента постановки диагноза [Stewart L.A., 2002, Zalutsky M.R, 2005].

3. МикроРНК miR-21 и глиома • МикроРНК играют важную роль в онкогенезе, включая развитие опухолей мозга. Уровнь экспрессии различных микроРНК значительно выше в опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой. • Экспрессия микроРНК miR-21 существенно повышена в девяти видах опухолей, включая мультиформную глиобластому и другие типы глиом. • МикроРНК miR-21 обладает мощным стимулирующим действием, способствуя росту и пролиферации опухолевых клеток глиом. • Подавление экспрессии микроРНК miR-21 в тканях глиомы, должно существенно снижать пролиферативный и инвазивный потенциал опухолевых клеток, а также усиливать их чувствительность к противораковой терапии.

4. Биогенез микроРНК miR-21 Анти-miR-21 siRNA Natsumeet al. 2011

6. Взаимодействие микроРНК с онкогенными сигнальными механизмами в глиомах Silberet al. 2009

7. В настоящем проекте предлагается подавить экспрессию микроРНК miR-21 в клетках глиомы путем адресной доставки терапевтического агента - смеси олигонуклеотидов, способных подавлять экспрессию miR-21, непосредственно в опухолевые клетки. Цель проекта

8. Задачи исследования • Создание векторного наноконтейнера (иммунолипосом) для адресной доставки терапевтического агента в глиому. • Загрузка иммунолипосом терапевтическим агентом: смесь олигонуклеотида, имеющий антисмыслую последовательность (анти-miR-21) к данной микроРНК, а также малая интерферирующая РНК (siRNA), специфически подаляющая синтез первичной РНК-предшественника miR-21. • Оценка эффекта противопухолевого действия данной системы на первичных клеточных культурах глиобластомы человека (U87 или U251). • Оценка эффективности комбинированной терапии иммунолипосомами и противораковым лекарством (антимитотическим агентом таксолом или моноклональными антителами против VEGF (авастином))in vitro

9. Методы решения задач: синтез • Синтез иммунолипосом: наночастицы, несущие на своей поверхности ковалентно связанные нейроспецифические моноклональные антитела против коннексина-43 (Сх43) в качестве векторных групп. экспрессия поверхностного белка Сх43 по периферии глиомы существенно повышена в связи с тем, что Сх43 необходим для формирования плотных межклеточных контактов между опухолевыми и неопухолевыми клетками и активной миграции по перивазальным и периневральным путям. Высокая экспрессия коннексина 43 в активно мигрирующих глиомных клетках должна гарантировать крайне селективную доставку наноконтейнеров, коньюгированных с антителами против Сх43 • Оценка стабильности систем, их размера, заряда и полидисперсности. • Оценка степени загрузки терапевтическим агентом

10. х о л и н ф о с H C C H 3 3 N O C H C C H 2 3 H O P O 2 3 - ф о с ф о г л и ц е р и н O H C H 2 C H C 2 O O C C O H C 2 O H C 2 C H 2 C H 2 H C 2 H C C H 2 2 C H 2 H C 2 H C 2 C H 2 C H H C 2 2 H C 2 C H C H 2 C H H C 2 H C C H 2 2 C H H C 2 2 H C C H 2 2 C H H C 2 2 H C C H 2 2 C H H C 2 2 H C C H 2 2 C H H C 3 3 о л е и л с т е а р о и л Создание липосомальных систем Ф о с ф а т и д и л х о л и н Х о л е с т е р и н Ф о с ф а т и д и л э т а н о л а м и н ф а т и д и л э т а н о л а м и н ф о с ф а т и д и л O H N H 3 O C H C Гидрофльная голова 2 C H H O P O 2 H C C H 2 2 O 3 - ф о с ф о г л и ц е р и н H C H 2 C H C C 2 H C 2 O C C H O H C 3 C C O H C C H C H 2 O H C 2 2 C H 2 C H H C H C 2 2 2 H C 2 C H 2 C H H C 2 C H 2 H C H C 2 2 C H 2 C H C H C 2 C H 2 H C 2 H C 2 C H Гидрофобный хвост 3 C H 2 C H C H H C C H 2 2 H C H C C H 2 3 C H 2 C H H C 2 2 H C C H 2 C H 2 2 C H H C 2 2 H C H C C H 2 2 2 C H H C 2 2 C H H C C H 2 2 2 H C C H H C 3 C H 3 3 с т е а р о и о л е и л C H л 3

11. Векторные липосомы с загруженным терапевтическим препаратом PEG Моноклональные антитела к Сх43

12. Методы решения задач: анализ • Анализ векторной иммунолипосомальной системы с загруженным терапевтическим агентом (Анти-miR-21 и siRNA) 1) подбор параметров для сохранения иммунохимической активности векторных групп (иммуноферментный анализ) 2) подбор условий для получения наноконтейнеров с максимальной степенью загрузки терапевтическим агентом 3) анализ сохранения/высвобождения Анти-miR-21 и siRNA Электрофорез Конкурентный ИФА

13. Методы решения задач: in vitro • Оценка эффекта противоопухолевого действия данной системы на первичных клеточных культурах глиобластомы человека (U87 или U251) После связывания иммунолипосомы с клеткой-мишенью ее содержимое (анти-miR-21 и siRNA) будет попадать в цитоплазму опухолевой клетки и активироваться внутриклеточной эндонуклеазой DICER, участвующей в естественном процессе перехода предшественников микроРНК в зрелые микроРНК. Анти-miR-21, будучи превращена в одноцепочечную активную форму, будет комплементарно связываться со зрелой miR-21 в цитоплазме и тем самым инактивировать ее. SiRNA будет специфически связываться с РНК предшественником miR-21 и способствовать ее последующей деградации.

14. Методы решения задач: in vivo в случае положительного результата на культурах опухолевых клеток • Воспроизведение модели экспериментальной глиомы на животных с помощью стереотаксической имплантации в стриатум предварительно кльтивированных клеток глиомы • Сравнительная оценка эффективности действия загруженных иммунолипосом, модифицированных нейроспецифическими и неспецифическими антителами, in vivo • Исследование противоопухолевой активности, токсичности препаратов, а также средней продолжительности жизни экспериментальных животных с глиомой.

15. Ожидаемые результаты Препарат иммунолипосомальных наночастиц, загруженных олигонуклеотидами для специфического подавления экспрессии онкомикроРНК miR-21, и коньюгированных с моноклональными антителами к коннексину-43 • специфическое подавление роста и пролиферации клеток глиом • адресная доставка к опухолевым клеткам • снижение радио- и хемоустойчивости глиом • лечение глиом