第三章 DNA 复制 (Replication of DNA)

1. 第三章DNA 复制 (Replication of DNA)

2. DNA 复制一般特征 • 参与DNA复制的酶类 • DNA复制基本过程 • DNA复制的调控 • DNA损伤与修复

3. 第一节 DNA复制的一般特征 一、DNA的生物学功能 1、储存遗传信息 2、复制遗传信息 3、表达遗传信息 4、遗传变异 1962, Nobel Prize

4. Watson(Nature,1953) :我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。

5. 全保留 半保留 分散式 二、DNA复制方式 DNA如何进行复制？

6. 15N P0 P1 P2 P3 P4 P0＋P2 P0＋P4 14N 15N/14N 15N Meselson-Stahl experiment 1958, PNAS

7. 根据实验结果：第一代DNA仅有一条带否定了全保留复制的可能根据实验结果：第一代DNA仅有一条带否定了全保留复制的可能 第二代出现两条带，一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能，证明DNA只能是半保留方式进行复制 DNA的半保留复制Semiconservative Replication DNA双链解开，以单链做模板，碱基互补原则，各自合成一条链。在新合成的DNA双链分子中，一条是原来的老链，一条是新链。

8. 2 DNA复制的半不连续性 复制时DNA链延伸可能有三种方式： 没有从3’ 5’ 延长DNA链的聚合酶 1 2 3 1967年，日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生100～1000bp的短片段

9. 2 DNA复制的半不连续性 • 一条链连续合成，称主导链，Leading Strand 另一条链分段合成，称随从链Lagging Strand。 • 原因：DNA双螺旋分子两条链方向相反，新链合成的方向只能5’→3’一个方向合成。

10. 3 DNA复制的双向性 在两个方向同时进行，形成两个复制叉(Replication Fork ).

12. 概括： • 半保留 • 半不连续性 • 双向性

13. 第三节 参与DNA复制的酶类 参与DNA复制的酶或蛋白因子： 1 DNA聚合酶 催化DNA的合成 2 引物酶 起始RNA的合成 3 连接酶 连接冈崎片段 4 DNA解链，解旋酶 5 DNA结合蛋白

14. 一 DNA聚合酶(Polymerase) 1956年，大肠杆菌DNA聚合酶 1959，Nobel Prize （一） 作用机制 以DNA做模板，碱基互补配对，催化4种dNTP之间形成磷酸二酯键，从而延长DNA链。

15. Mg2+

16. 在模板链上进行 • 不能从头合成，在引物的3’OH端上延长 • 新链延长方向为5’→3’延长

17. （二）原核生物DNA聚合酶 • 有3种：DNA聚合酶 I，II，III。 • 多功能酶： • 合成DNA的活性 聚合酶作用,延长DNA链。 • 水解DNA的活性 外切核酸酶活性,切除不配对碱基，起校读作用

18. 1、DNA聚合酶 I 大肠杆菌DNA聚合酶I ： 单链多肽蛋白质,分子量为109KD. 性质：多功能酶 大亚基：5’→3’聚合酶活性 3’→5’外切酶活性 小亚基：5’→3’外切酶活性。 1000nt/min

19. 3’→5’外切酶活性 􀁺 从游离3’－OH端切割,识别和消除不配对的核苷酸，保证了DNA复制的忠实性。 5’－3’外切酶活性 DNA聚合酶I中的小亚基带有5’外切酶活性，从双链DNA的5’端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸。

22. 3’→5’外切活性示意图

23. DNA聚合酶特有活性

24. DNA聚合酶I 在DNA复制中所起的作用 • 不是主要的复制酶 • RNA引物的切除 • DNA损伤的修复：紫外线作用形成的TT二 聚体的切除 • 链置换： 可能参与遗传重组 • 切口平移（nick translation） 探针标记

25. 2 DNA聚合酶II • 不是复制酶，主要在DNA修复中起作用，无5’→3’外切酶活性。 5% DNA聚合酶I的活性

26. 3 DNA聚合酶 III 1972年发现 催化效率高，主要复制酶。由10种亚基组成：       ’    （1）核心聚合酶：  ：5’－3’DNA聚合酶活性  ：3’-5’外切酶活性，控制 复制忠实性 ：核心酶的组建

27. （2） 二聚体： 构成滑动钳，将全酶固定在DNA模板上，提高合成速率（20/秒----750/秒。 （3） 复合物 ：2’ 协助  二聚体结合到 DNA

28.       ' '     ε ε           E. coli DNA聚合酶Ⅲ不对称二聚体

30. DNA聚合酶 III • 形成不对称的二聚体，与DNA双链结合，后随链折叠1800，使后随链的物理方向与主导链一致，同时催化两条链的复制。

31. 3 3´ 5´ 3´ 5 解链方向 3 5´ 5´ 3´ 5 领头链 (leading strand) 后随链 (lagging strand)

33. 大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较 DNA 聚合酶 polⅠ polⅡ pol Ⅲ 亚基数目 1 ≥7 ≥10 5 ′→3 ′聚合酶活性 + + + 3 ′→5 ′外切酶活性 + + + 5 ′→3 ′外切酶活性 + -- 聚合速度(核苷酸/分) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力 3-200 1 500 ≥500 000 功能 切除引物,修复 修复 复制

34. （三） 真核生物DNA聚合酶

35. DNA聚合酶的作用 • DNA聚合酶 : 多亚基、多功能酶。 • 大亚基：DNA聚合酶活性。 100nt/次 • 小亚基：引物酶活性，合成RNA。 • 起始DNA的合成：合成RNA引物和在RNA3’羟基端合成一段DNA。

36. DNA聚合酶的作用 • DNA聚合酶的结构 • 多亚基组成： • P125 大亚基，催化亚基，含聚合酶和 外切酶活性 • P50 与增殖细胞核抗原(PCNA)结合相关 • P66 • P12

37. DNA聚合酶的功能 • 主要DNA复制酶：DNA聚合酶活性，延伸DNA链。 与RFC和PCNA形成“全酶”，在RFC和PCNA等的协同下，促使DNA聚合酶的解离， DNA聚合酶接替DNA聚合酶继续DNA链的合成------- DNA聚合酶向DNA聚合酶的转换。 • 复制校正功能：3’-5’外切核酸酶活性

38. DNA聚合酶 、 主要功能：DNA修复。 • DNA聚合酶γ：线粒体DNA复制

39. 二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白 1、PCNA：增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen)， DNA聚合酶的附属蛋白，参与DNA的合成，类似二聚体。 2、RFC：复制因子C(Replication Factor C)。多亚基复合物，DNA聚合酶的附属蛋白，识别引物末端,参与链的延长。类似复合物。

40. 3、PRP1和PRP2 Primer Recognition Protein 增加DNA聚合酶与模板－引物末端的亲和力，增加DNA聚合酶的活性。

41. PCR 与Taq DNA 聚合酶 Taq DNA聚合酶特性（Taq DNA polymerase） 最初由H.A.ErlicH从热泉中的细菌中出来 􀂙 性质 具有5’－3’聚合酶活性以及依赖于聚合作用的 外切酶活性 􀂙 耐热性 此酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶 最适反应温度为72℃－80℃ 􀂙 应用 能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA 为模板，进行DNA的体外扩增－PCR反应。

42. 三 引物酶 primase DNA聚合酶不能引发DNA新生链的合成，只能在已存在的DNA链或RNA链上延长DNA。引物酶催化引物RNA的合成。

43. 四 连接酶 ligase • 1967年发现 • 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段必须都与完整的模板链结合。 • 大肠杆菌的连接酶需NAD+，真核细胞的连接酶需要ATP。 • 可连接双链DNA中的单链切口，RNA-DNA杂交体双链单链切口，不能连接双链RNA中的单链切口。

44. 五 与DNA解链和解旋有关的酶

45. 五 与DNA解链和解旋有关的酶 （一）DNA螺旋酶（Helicase） • 催化双螺旋解旋和解链 • 需消耗ATP

46. （二）拓扑异构酶（Topoisomerase) • DNA 回旋酶（Gyrase） • 促进DNA双链的解开,需消耗ATP。 • 兼有内切酶和连接酶活性, 可迅速使DNA两条链断开又接上, 消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量, 同复制有关。

48. （三）单链结合蛋白 • DNA单链结合蛋白（Single Strand Binding protein，SSB） • 复制因子A • 主要功能： 与单链亲和力大，稳定单链结构，保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成，有利复制进行。

50. 第二节 DNA 复制的基本过程