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第八章 基因重组与分子生物学技术. 学习要点：. 一、基因重组技术 1 ．基因重组技术的概念 2 ．基因重组技术基本原理 3 ．基因重组技术与医学的关系 二、分子生物学常用技术 1. 核酸分子杂交与探针技术 2. 分子印迹技术 3. 聚合酶链反应技术 4. DNA 序列分析技术. 第一节 基因 重组技术. 重组 DNA 技术又称为 基因工程 （ genetic engineering ）或 分子克隆 (molecular cloning) 。. 基因重组 (gene recombination) :
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学习要点： 一、基因重组技术1．基因重组技术的概念2．基因重组技术基本原理3．基因重组技术与医学的关系 二、分子生物学常用技术 1. 核酸分子杂交与探针技术 2. 分子印迹技术 3. 聚合酶链反应技术 4. DNA序列分析技术
第一节 基因重组技术 • 重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆 (molecular cloning)。
基因重组 (gene recombination): DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 • 基因工程 (genetic engineering）: 采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。
相关实验： • 1964年Gurdon等进行的非洲爪蟾实验 • 1970年Steward等用悬浮培养的胡萝卜单个 • 细胞培养成可育的胡萝卜植株。 • 1997年英国学者克隆出“多莉”羊
一、基因重组基本过程 • ① 载体和目的基因的分离； • ② 载体和目的基因的切断； • ③ 载体和目的基因的重组(接)； • ④ 重组DNA的转化和扩增； • ⑤ 重组DNA的筛选和鉴定。
Vector Target DNA Recombinant plasmid/DNA Clone
酶类 主要用途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链 DNA聚合酶I ①缺口平移制作标记DNA探针 ②合成cDNA的第二链 ③填补双链DNA3’末端 ④DNA序列分析 耐热DNA聚合酶 （Taq DNApol等） 聚合酶链反应（PCR） DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段 二、工具酶 (一) DNA重组技术中最常用的工具酶
（二）限制性核酸内切酶作用特点 • ① 产生5’突出粘性末端 (cohesive end): • 以EcoR I为例： • 5’…G↓AATT C…3’ → 5’…G -pTTAAC…3’ • 3’…C TTAA↑G…5’ → 3 '…CTTAA p - OH G…5'
② 产生3’突出的粘性末端： 以PstⅠ为例： 5’…CTGCA↓G…3’ → 5’…CTGCAOH- pG…3’ 3’…G↑ACGTC…5’ → 3’…Gp- OHACGTC…5
③ 产生平末端(blunt end): Nru Ⅰ 为例： 5’…GTT↓AAC…3’ → 5’…GTTOH- pAAC…3’ 3’…CAA↑TTG…5’ → 3’…CAAp -OHTTG…5’
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)在重组DNA技术中有重要地位
限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近1800多种，可根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近1800多种，可根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。
配伍末端： 识别序列不同，但切割DNA后产生相同类型的粘性末端。
三、载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
1．质粒 • 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 • 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。
2．噬菌体 • 可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。
3．病毒 • 常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。
理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： ① 能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要 有较高的自主复制能力。 ② 容易进入宿主细胞，而且进入效率越高 越好。 ③ 容易插入外来核酸片段，插入后不影响 其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化出来。 ⑤ 有容易被识别筛选的标志。
一、目的基因的获得 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： 1．直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。
2．人工合成 • 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。
3.从mRNA合成cDNA • 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。
4．从基因文库中筛选 • 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。 • 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。
5．利用PCR合成 • 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。
二、载体和目的基因的切断（切） • 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 • 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 • 由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。
三、载体和目的基因的重组（接） • 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。 （一）黏性末端连接法： • 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 • 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。
（二）人工接尾法 • 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得黏性末端时，可采用此方法。 • 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3‘-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行黏合，再由DNA连接酶连接。
（三）人工接头法 • 将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的黏性末端。
四、重组DNA的转化和扩增（转） • 重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒DNA短暂温育，质粒DNA即可导入宿主细胞。
如果是用λ噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfection)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。如果是用λ噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfection)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。 • 重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对于质粒DNA，还可通过在培养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体DNA的复制，以单独扩增细胞中的质粒DNA。
五、重组DNA的筛选和鉴定（筛） • 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行： （一）根据重组体的表型进行筛选： • 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。
（二）根据标志互补进行筛选 • 当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。
（三）根据DNA限制酶谱进行分析 • 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。
（四）用核酸杂交法进行分析鉴定 • 为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。
获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。
1.什么是基因重组技术？它包含那些内容？ 2.列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。 3.叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。 4.怎样获得目的基因或核酸序列的克隆？有那些 方法？要经过那些基本步骤？ 5.怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？
一、分子杂交与探针技术 （一）分子杂交 • 不同来源的单链核酸（DNA或RNA），只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为分子杂交（molecular hybridization）。 • 利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。
（二）探针技术 • 将已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。
二、分子印迹技术 • 印迹技术的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。其基本操作过程是：将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置NaOH液中浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置80℃烘干并使单链DNA分子固定在膜上，再用于分子杂交分析。因此，用于DNA印迹的技术又称为Southern Blotting或Southern 杂交。
分子印迹技术的种类 （一）DNA印迹技术： • 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。 （二）RNA印迹技术： • 又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。 （三）蛋白质印迹技术： • 又称为Western杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
三、PCR技术 （一）PCR的概念 • PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 • 理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106～109倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。
（二）PCR反应系统的组成 PCR反应系统应包括： 1．耐热DNA聚合酶（Taq酶） 这是由耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可保证在950C，30分钟以上不会变性失活。 2．模板DNA即待分析的目的DNA，其长度不宜大于10kb。 3．两种引物 为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的3’-端。
