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实验 双缩脲法测定蛋白质浓度

实验 双缩脲法测定蛋白质浓度. 实验目的 1. 学习分光光度法测定的原理和方法 2. 学习蛋白质含量测定的原理和方法 3. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法. . 10 -2 nm 10 nm 10 2 nm 10 4 nm 0.1 cm 10cm 10 3 cm 10 5 cm.  射线. x 射线. 紫外光. 红外光. 微波. 无线电波. 可 见 光. 分光光度法.

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实验 双缩脲法测定蛋白质浓度

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  1. 实验 双缩脲法测定蛋白质浓度

  2. 实验目的 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习蛋白质含量测定的原理和方法 3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法

  3. 10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm 射线 x射线 紫外光 红外光 微波 无线电波 可 见 光 分光光度法 原理：物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法，常用紫外—可见分光光度法。 光的电磁波性质

  4. A 增大 C  定性分析与定量分析的基础 A 定性分析基础 物质对光的选择吸收  定量分析基础 在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。

  5. Lambert—Beer定律 I I0 样品 参比 透射光 I 入射光 I0 lg(1/T)= CL T（透射比）=I/I0=10-CL A=εCL A为吸光度；ε为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 • 一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。 • 在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。

  6. 应用 （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm， 核酸的最大吸收波长为260nm。 （3）比较吸光度的比值 纯DNA

  7. 常用方法 标准系列 未知样品 • 1.标准曲线法 • 配制一系列不同浓度的标准溶液（至少5个）按测定管同样方法处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度（A），以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度（C）为横坐标，制作标准曲线。 • 根据样品的A从标准曲线上查得样品含量，再计算出样品的浓度。　　　

  8. 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 待测样品的浓度必须在标准曲线范围内。

  9. 2. 标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 3. 摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。）

  10. 分光光度计的使用

  11. 0.575 紫外-可见分光光度计 光源 单色器 检测器 显示 吸收池 单波长单光束分光光度计

  12. 1．722型分光光度计的外形

  13. 2.仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长

  14. 3.样品测试操作 ① 打开电源开关，使仪器预热20分钟 ② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 ③ 打开样品室盖，将参比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠近测定者一端位置，并将样品溶液倒入比色皿中放入比色皿架的其它位置，盖好样品室盖。 ④ 拉动比色皿架拉杆一小格使比色皿架挡住光路，按“0%T”键调透射比为零 ⑤ 推入比色皿架使参比溶液位于光路中，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 ⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式A，此时应显示为0，如果不是则按“100%T”再调A零 ⑦ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数 ⑧实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。在签名本上签名。

  15. 光路 返回

  16. 光路 返回

  17. 返回

  18. 美谱达V-1100D可见分光光度计 测量前的准备 开机自检：确认仪器光路中无阻挡物，关上样品室仪器电源开始自检 预热：仪器自检完成后进入预热状态，预热时间需在30分钟以上 使用说明 测量模式选择：按MODE键可切换测量模式 设置波长：转动波长旋钮可设置测试波长，波长值可从显示器实时读取 校准零位：按▽可校准零位 校准100%T：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按△可校准100%T 测量吸光度 第一步：按MODE键选定模式为“A”模式 第二步：旋转波长旋钮到测试波长 第三步：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按△校准100%T 第四步：将放有“样品”的样品槽置于光路中，读取吸光度值

  19. 752型分光光度计

  20. 美谱达UV-1200紫外-可见分光光度计

  21. 蛋白质含量测定的原理和方法

  22. 微量凯氏定氮法 • 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 • 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。

  23. N +浓H2SO4 CO2+SO2+H2O+NH3↑ H2O+Na2SO4+NH3↑ NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 NH4HB4O7+HCl+H2O NH4Cl+H3BO3 (NH4)2SO4+NaOH NH3+H3BO3 NH4HB4O7+H2O 氮的总量测定—凯氏定氮法 消 化 蒸 馏 吸 收 滴 定

  24. 双缩脲法 原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg 540 nm

  25. Folin-酚试剂法(Lowry法) • Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高（20-250g）、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。

  26. 紫外分光光度法 • 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 • 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

  27. 总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉） 准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/mL；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/mL 快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便 经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝

  28. 基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

  29. 考马斯亮蓝染色法 • 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高10－100μg （比Lowry法灵敏4倍）。

  30. O CH CH 2 3 Coomassie G-250 NH PROTEIN + CH CH 3 3 C + CH CH N N CH CH 3 2 2 3 CH CH 2 2 Acid - SO SO Na 3 3 BLUE Protein - Dye Complex Amax = 595nm Coomassie Dye-Based 蛋白质定量

  31. 蛋白质含量的测定

  32. 本次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量

  33. 一、操作步骤 1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组） 2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL，37oC反应30min。 3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。

  34. 二、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。 三、注意事项 1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.用坐标纸绘制标准曲线，注明轴名称及单位。 4.比色杯的使用

  35. 微量移液器的使用

  36. 吸液：调好量程后，用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点，吸取所需液体。吸液：调好量程后，用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点，吸取所需液体。 • 排液：接着将按钮按至第一停点，排出液体 • 排出残液：稍停片刻继续按按钮至第二停点，吹出残余的液体。最后松开按钮。 返回

  37. 移液器使用注意事项 • 设定量程时，切忌使移液器量程旋钮超出其标示的最小和最大量程。 • 在将枪头套上移液器时，切忌使劲地用枪砸枪头盒。 正确的方法是将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。 • 吸液时，要轻推轻吸，切忌将样品吸入移液器腔内。当移液枪头里有液体时，切忌将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。 • 使用完毕，把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧，竖直挂在移液枪架上。

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