背景知识五：微生物纯培养技术

1. 背景知识五：微生物纯培养技术 武汉职业技术学院 微生物技术应用

2. 微生物纯培养技术 一、新陈代谢是什么？ 二、微生物产能代谢有几种？各有哪几种途径？发酵和呼吸有什么相同和不同？ 三、微生物的耗能代谢有哪几种？ 四、如何调节微生物的代谢？ 五、微生物次级代谢有什么特点？ 六、微生物纯培养技术包含哪几种操作？各种操作的方法是怎样的？

3. 一 代谢概论 新陈代谢是指发生在活细胞中的各种分解代谢与合成代谢的总和，简称代谢。 微生物代谢的特点 ①代谢速率快 ②代谢方式多样化 ③高度的适应能力

4. 代谢作用包括分解代谢和合成代谢，或者分别称为异化代谢和同化代谢。 分解酶类 复杂分子 简单分子+ATP+[H] （ 有机物）合成酶类 分解代谢 生物大分子分解成生物小分子 代 释放能量——产能代谢 能量代谢 物质 谢 合成代谢 需要能量——耗能代谢 代谢 生物小分子合成为生物大分子

5. 二 微生物的产能代谢 • 研究微生物产能代谢就是研究微生物如何把外界环境中的最初能源转变成生命活动的通用能源——ATP。 化能异养菌 有机物 化能自养菌 还原态无机物 通用能源ATP 光能自养菌 日光

6. 一、化能异养微生物的生物氧化 化能异养微生物的产能代谢实质：有机物的生物氧化 有机物生物氧化的形式就是脱氢或失去电子，其过程包括脱氢（电子）、递氢（电子）和受氢（电子）三个阶段，依据最终氢受体性质不同，化能异养微生物的生物氧化分为发酵和呼吸两种类型

7. 耗能阶段 产能阶段 2NADH+H 2丙酮酸 2C3 C6 2ATP 4ATP 2ATP 二 微生物的产能代谢 （一）底物脱氢的途径 底物脱氢主要有四要途径，每条途径都有脱氢、产能和产生小分子中间代谢物的功能。 1．EMP途径

8. 二 微生物的产能代谢 在有氧条件下，EMP途径与TCA途径连接。 EMP途径生理功能极其重要： （1）供应ATP形式的能量和NADH2形式的还原力； （2）连接其他几个重要代谢途径； （3）为生物合成提供多种中间代谢产物； （4）通过逆向反应可进行多糖的合成。

9. 12NADPH+12H+ 6C5 5C6 6C6 6CO2 2、HMP途径 其特点是葡萄糖不经EMP途径和TCA途径而得到彻底氧化，并能产生大量的NADPH+H+形式的还原力和多种中间代谢物。

10. 意义： （1）供应合成原料； （2）产生还原力； （3）作为固定CO2的中介； （4）扩大碳源的利用范围，为微生物利用 C3～C7多种碳源提供了必要的代谢途径； （5）连接EMP途径，可为生物合成提供更多的戊糖。

11. NADH+H+ NADPH+H+ 2丙酮酸 KDPG C6 ATP 2ATP ATP 3．ED途径 ED途径又称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG）裂解途径，是少数缺乏完整EMP途径的微生物的一种替代途径。

12. 特点： ①1分子葡萄糖只经4步反应即得2分子丙酮酸，但这2分子丙酮酸来源不同，1分子由KDPG裂解产生，另一分子则由3-磷酸甘油醛经EMP途径转化而来； ②ED途径产能效率低，1分子葡萄糖经ED途径分解只产生1分子ATP。

13. 呼吸链 4NADH+4H+ 12ATP 呼吸链 2ATP FADH2 ATP CH3CO~CoA GTP（底物水平） C3 3CO2 4.三羧酸循环/TCA循环/Krabs循环/柠檬酸循环

14. 特点： （1）必须在有氧条件下，因为NAD+和FAD的再生需要氧气； （2）产能效率高，每个丙酮酸分子的彻底氧化可高效地产生15个ATP； （3）TCA循环在一切分解代谢和合成代谢中都占有枢纽的地位，为微生物的生物合成提供各种碳架原料。

15. （二）发酵 工业上发酵是指任何利用好氧或厌氧微生物产有用代谢产物的一类生产方式。 根据发酵产物，发酵的类型主要有乙醇发酵、乳酸发酵、丙酮丁醇发酵、混合酸发酵、斯提克兰反应（Stickland反应）等

16. 1.乙醇发酵 2.乳酸发酵 3.丙酸发酵 4.丁酸发酵 5. 混合酸发酵 6. 丁二醇发酵 7.氨基酸的发酵产能­——Stickland反应

17. （三）呼吸作用 葡萄糖脱氢后，产生的还原力[H] 经呼吸链传递，最终外源分子氧或其他氧化型化合物接受，并产生较多ATP，则此过程为呼吸作用。 有氧呼吸：最终氢（电子）受体为分子氧 无氧呼吸：最终氢（电子）受体为其他氧化型化合物 巴斯德效应。

18. 1.有氧呼吸 在有氧条件下，微生物以分子氧作为呼吸链最终氢（电子）受体，进行有氧呼吸，1分子葡萄糖彻底氧化为CO2和H2O共产生38分子ATP 共分三个阶段： • 1葡萄糖→ → →2丙酮酸（EMP途径）+ 2ATP+2NADH+H+； • 2丙酮酸→ → →2乙酰COA +2NADH+H+； • 2乙酰COA分别进入TCA循环，共产生6NADH+H+和2FADH2，2GTP 真核微生物有氧分解1分子葡萄糖实际净得36分子ATP

19. 2.无氧呼吸/厌氧呼吸 （1）硝酸盐呼吸/反硝化作用/硝酸盐还原 • NO3-还原成NO2-、NO、N2O、N2 • 一些兼性厌氧菌——反硝化细菌，如地衣芽孢杆菌、脱氮副球菌、铜绿假单胞菌和脱氮硫杆菌等 • 在通气不良的土壤中，反硝化作用会造成氮肥的损失，其中间产物NO和N2O还会污染环境；

20. （2）硫酸盐呼吸 /反硫化作用/硫酸盐还原 • 反硫化细菌以SO42-为最终电子受体，把SO42- 还原成H2S的过程 • 反硫化细菌或硫酸盐还原细菌，它们为严格厌氧菌，包括脱硫弧菌属、脱硫单胞军菌属、脱硫球菌属等。 • 许多硫酸盐还原细菌喜欢以乳酸作为氧化基质，SO42-为最终电子受体，还原成H2S, 乳酸经丙酮酸被氧化为乙酸和CO2。

21. （3）硫呼吸/硫还原 以元素硫作为最终电子受体并产生的H2S 一些兼性或专性厌氧菌，如乙酸氧化脱硫单胞菌能在厌氧条件下通过氧化乙酸为CO2和还原元素硫为H2S的偶联反应而生长。 （4）碳酸盐呼吸/碳酸盐还原 CO2或碳酸氢盐（HCO3-）为呼吸链末端电子受体

22. （5）铁呼吸 是指以Fe3+为最终电子受体的无氧呼吸方式。 （6）延胡索酸呼吸 以延胡索酸作为外源末端电子受体，还原产物为琥珀酸。 一些兼性厌氧菌，如埃希氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属等肠杆菌；一些厌氧菌如拟杆菌属、丙酸杆菌属、产琥珀酸弧菌等

23. 二、化能自养微生物的生物氧化 化能自养微生物以CO2为主要或唯一碳源，靠氧化无机物而获得能量和还原力[H]，所产生的氢（电子）直接进入呼吸链氧化磷酸化，因而产能效率低

24. 1. 氢细菌 氢细菌是一些呈革兰氏阴性的兼性化能自养菌 在有氢（作为能源）有氧存在时，不能利用有机物；而在无氢有氧时，可利用有机物为能源生长 6H2+2O2+ CO2→[CH2O]+5H2O 2. 硝化细菌 • 硝化细菌为专性好氧的G＋细菌，大多数是专性无机营养型，它们能以铵盐（NH4+）和亚硝酸盐(NO2-)作为能源。

25. 3. 硫细菌 硫杆菌等 进行化能自养的硫细菌通过氧化无机硫化合物(包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐)获得能量，进行生长。 4. 铁细菌 少数能氧化Fe2+成为Fe3+并产能的细菌 大多数铁细菌为专性化能自养，但也有些铁细菌为兼性化能自养，如氧化亚铁硫杆菌在缺乏可被氧化的铁时，也能利用葡萄糖进行异养生长。

26. 三、光能自养微生物的氧化和产能 光合磷酸化:利用光能进行磷酸化生成ATP的过程 光合磷酸化的实质是将光能转变成化学能，在这种转变过程中，光合色素起着重要的作用。

27. 1. 蓝细菌的光合磷酸化过程 蓝细菌在光合作用中以H2O作为氢供体，水光解产氧气，因此这类光合作用称为放氧性光合作用。 在蓝细菌的光合作用中，光合系统Ⅰ和光合系统Ⅱ受光驱动所释放的电子都不流回到原来各自的系统中，两个系统是靠由其它途径得到的电子还原的，因此称为非环式光合磷酸化。

28. 2. 光合细菌的光合磷酸化过程 光合细菌只有一个光合系统，在厌氧条件下依靠菌绿素进行光合作用. 以还原型的无机硫、氢或有机物作为氢供体，没有氧气的释放，称为非放氧性光合作用。 进行非放氧性光合作用的光合细菌主要是紫色细菌和绿色细菌

29. 3. 嗜盐菌的光合磷酸化过程 嗜盐菌不含菌绿素或叶绿素，也不存在电子传递链，它们通过其特有的位于质膜中的细菌视紫红质进行光合作用。

30. 三、微生物能量和转换 （一）底物水平磷酸化： （二）氧化磷酸化： （三）光合磷酸化：

31. 三 微生物的耗能代谢 微生物的耗能代谢主要指微生物的合成代谢 一、二氧化碳的固定 在微生物中，至今已了解的CO2固定的途径有三条，即Calivin循环、厌氧乙酰辅酶A途径和还原性三羧酸循环途径。 （一）Calivin循环 （二）厌氧乙酸辅酶A途径 /活性乙酸途径 （三）还原的三羧酸循环

32. 二、生物固氮 生物固氮是指分子氮通过微生物固氮酶系的催化而形成氮的过程。 （一）固氮微生物与固氮体系 • 自生固氮菌： • 共生固氮菌： • 联合固氮菌

33. （二）固氮的生化机制 固氮酶 N2+8e-+8H++NATP Mg2+ 2NH3+H2+NADP+ nPi（18≤n≤24）

34. （三）固氮作用的抑制 1.氨“关闭”效应，当在富氨环境中时，固氮酶受到抑制。 2.某些物质作用于电子的活化与传递，也能抑制固氮作用，如硫基化合物、氧化磷酸化和光合磷酸化的解偶联剂等。 3.竞争性抑制 除N2外，还有多种底物能与固氮酶结合

35. （四）好氧性固氮菌固氮酶的抗氧机制 1.好氧性自生固氮菌 （1.）呼吸保护： （2.）构象保护 2.蓝细菌固氮酶的保护 3.根瘤菌固氮酶的保护机制 （1.）.豆科植物共生根瘤菌 （2.）非豆科植物共生根瘤菌

36. 三、肽聚糖的合成 肽聚糖是细菌细胞壁所特有的成分，同时也是青霉素、万古霉素、环丝氨酸（亚唑霉素）与杆菌肽等许多抗生素作用的靶物质。

37. 四 微生物的代谢调节 微生物代谢调节主要有两种方式：酶合成的调节和酶活力的调节 一、酶合成的调节——基因水平 本质：通过调节酶的合成量来控制代谢速率 包括酶合成的诱导和酶合成的阻遏 诱导：促进酶生物合成的现象 阻遏：能阻碍酶生物合成的现象

38. 四 微生物的代谢调节 （一）酶合成的诱导 根据酶的合成对底物的依赖关系，酶 组成酶 诱导酶 组成酶是细胞固有的酶类，其合成是在相应的基因控制下进行的，不因分解底物或其结构类似物的存在而受影响 诱导酶的合成依赖于底物或底物结构类似物，诱使诱导酶合成的物质叫诱导剂。

39. 同时阻遏 酶1 酶2 酶3 高丝氨酸 蛋氨酸 （二）酶合成的阻遏 酶合成阻遏有两种类型：终产物阻遏和分解代谢物阻遏 1. 终产物阻遏 终产物阻遏是由某代谢途径末端产物的过量积累而引起的阻遏。 如E．Coli

40. 2．分解代谢物阻遏 • 当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时，故又称葡萄糖效应。

41. （三）酶合成调节的机制——操纵子学说。

42. 阻遏: 原先无活性的调节蛋白（不能与操纵基因结合） +辅阻遏物 调节蛋白活化 封闭了操纵基因

43. 二、酶活力的调节——酶分子水平 本质：通过改变现成的酶分子活性来调节代谢速率。 包括激活和抑制两个方面。 （一）激活 多在分解途径中，在激活剂作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性，这种现象称为激活。

44. （二）反馈抑制 反馈抑制是指生物合成途径的终产物反过来对该途径的第一个酶（调节酶）活力的抑制作用，使整个过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多积累。

45. E1 E2 E3 E4 A B C D P 反馈抑制 1．直线式代谢途径的反馈抑制 在直链反应A→B…→P中，当产物P积累过量时，产物P对顺序反应中的第一个酶E1的活性产生抑制作用。 例如，大肠杆菌在从苏氨酸合成异亮氨酸的途径中，合成途径中的第一个酶——苏氨酸脱氨酶就被末端产物异亮氨酸所抑制。

46. D E E1 B C A F G E2 2．分支代谢途径的反馈抑制 （1）同工酶调节 在分支代谢中，在分支点之前的一个较早反应（关键反应）是由几个同工酶催化时，分支代谢的几个终产物分别对这几个同工酶产生抑制作用，从而起到协同调节的功效。一个终产物控制一种同工酶，只有在所有终产物都过量时，几个同工酶才全部被抑制，反应完全终止。

47. E4 X E1 B A C D E5 （2）协同反馈抑制 分支代谢途径中催化第一步反应的酶有多个与末端产物结合的位点，可以分别与相应的末端产物结合。当酶上的每个结合位点都同各自过量的末端产物结合以后，才能抑制该酶活性。 Y

48. E1 C D E A B （3）积累反馈抑制 分支代谢途径中催化第一步反应的酶有多个与末端产物结合的位点，可以分别与相应的末端产物结合。当与末端产物结合时可以产生不同程度的抑制作用。

49. X E4 E1 B C D A E5 Y （4）顺序反馈抑制 分支代谢途径中的两个末端产物不能直接抑制代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，由高浓度的中间产物抑制第一个酶的活性。

50. （三）酶活力调节的机制 别构调节理论 主要的特征： （1）参与酶活性调节的变构因子是一类能与变构蛋白分子互补结合的小分子化合物（又称为效应物或调节性分子）； （2）正协同作用； （3）效应物同调节酶的结合与底物同酶的结合位点是分开但又有联系的； （4）酶的活性中心及调节性位点可同时被结合，产生不同的效应； （5）变构效应