140 likes | 334 Views
A DNS Szekvenálás. 2008 Géntechnikák labor. Bevezetés. Restrikciós enzimek / restrikciós térképek Genom könyvtárak Fehérje aminosavsorrend meghatározás Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása, vakcinarezisztens mutánsok) Direkt szekvenálás Egyféle termék Klónozott PCR termék
E N D
A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor
Bevezetés • Restrikciós enzimek / restrikciós térképek • Genom könyvtárak • Fehérje aminosavsorrend meghatározás • Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása, vakcinarezisztens mutánsok) • Direkt szekvenálás • Egyféle termék • Klónozott PCR termék • Többféle termék • Egymásra rakódó szekvenciák • Klónozás plazmidba
Módszerek • Maxam-Gilbert-féle kémiai degradáció • 5’ radioaktív izotópos jelölés (32P) • Bázis specifikus hasító reakciók • Elektroforézis, autoradiogramm • Mérgező anyagok, négy reakció • Sanger-féle enzimatikus módszer • Automatizálható!!!!! • Az eljárás közben nő a DNS mennyisége, tehát kisebb mennyiségű is kimutatható • Egy reakcióban is megoldható • Fluoreszcens molekulával jelölt primer, vagy didezoxinukleotidok • PCR + Elektroforézis poliakrilamid gélben
Areakcióelegy: • Templát • Oligonukleotid primer • DNS polimeráz • Dezoxinukleotidok (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) • Didezoxinukleotidok (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)
A szekvenálás • Denaturáció • Anelláció • Egy primer • Elongáció • Véletlenszerű lánc termináció
Elválasztás • Elektroforézis kapillárisban (375μm / 75μm) • Nagy felület-térfogat arány → nagy hőleadóképesség → nagyobb feszültségnél sem melegszik annyira • Kis feszültség: szebb elválasztás • Poliakrilamid mátrix • Betöltés: nagynyomású nitrogén • nagy felbontás • Minta bejuttatása • Elektrokinetikus injektálás • Megfelelő neg. Ionok (DNS) legyenek csak! • Ha eltömődik a kapilláris, leesik az áramerősség
Detektálás • A jelölő molekulát lézerrel gerjesztjük, majd mérjük a fluoreszcenciát • Fluoreszcensen jelölt primer • Négy reakció • Mindegyikben csak egy didezoxinukleotid • Négy futtatás • Fluoreszcensen jelölt didezoxinukleotidok • Egy reakció • Egy futtatás • Minden ddNTP más hullámhosszon detektálható
Kiértékelés • A jelekből egy szoftver kromatogrammot készít, a bázisokat eltérő színű csúcsok jelölik. • Szekvencia ellenőrzés!!!!! • Olvashatatlannak ítélt pozíciók N betűi • Kiértékelési hibák • Kimaradt betűk
Szekvenciák összehasonlítása • Fontos mindkét szálat megszekvenálni, és összehasonlítani az eredményeket. • Összehasonlításhoz ingyenes internetes szoftverek. (Clustal, Multalin)
Irodalomjegyzék • Berencsi György: Orvosi molekuláris virológia • Multalin ( http://ribosome.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html )