해조류를 이용한 치매예방 및 기억력개선 기능성 식품개발

1. 해조류를 이용한 치매예방및 기억력개선 기능성식품개발 2012. 12. 12 한림대학교 강일준

2. 가파른 고령사회 진입 속도 [2000년 고령화 사회(노인인구: 7%)→2019년 고령사회(노인인구: 14%)] 치매의 심각성 치매 발병 국 내 세 계 • 치매 환자수 • 약 5,800 만명 [치매 환자수] 5년 만에 2.7배 증가 [총 진료비] 3268억원으로 5년만에 5.8배 증가 [노인장기요양보험] 44% 치매환자

4. 치매 치료제의 문제점 코그넥스(tacrine) Exelon (rivastigmine) Aricept (donepezil) The first approved drug in the United States (a potent AChE inhibitor) hepatotoxicity vertigo, emesis vertigo, emesis 구토 간독성 위장장애 부작용 천연물 유래 제품 개발 시급

5. 고령화 의료비부담 해양자원의 기능성 사회적 문제 치매환자 급증 인지능력 개선 및 치매 예방 물질 개발

6. 연구동향 • 알츠하이머병 치료 접근법 • Acetylcholinesterase inhibitors: Increase acetylcholine contents • β-Secretase inhibitors: Decrease β-amyloid protein accumulation • Antioxidants: Decrease ROS and free radical • 혈관성 치매 치료 접근법 • 뇌허혈/ 뇌졸중 예방 • 뇌 신경세포보호 • 뇌 신경세포재생

7. 후보소재도출 • 총 29종의 해조류를 채집하여 • 이들로부터 3가지의 용매추출물을 제조 • 항산화, 뇌신경세포 재생, AChE억제효과, • β-secretase 억제효과 등의 효능평가 • 이상의 연구를 통해 감태, 구멍쇠미역의 후보물질을 도출함

8. 감태 (Ecklonia cava E6) 분류: 갈조류 서식지: 동해안 식용 여부: 식용가능 특징: Seanol을 함유, 의약품원료로 사용

9. 구멍쇠미역 (Agarum clathratum, E13) 분류: 갈조류 서식지: 동해안 식용 여부: 식용가능

10. Mechanism of Aβ secretion via β-secretase β-secretase inhibition = sAPPα/sAPP(sAPPα+ sAPPβ) 정상인 AD환자 Human APP(amyloid precursor protein) swedish mutants를 발현하는 plasmid를 함유한 HEK293T cell

11. Effects of butanol extract of E. cava on APP processing • The butanol extract did not show any toxicity in the HEK293-APPsw stable cells • (A)The culture media (sAPPs) and cellular lysates (CTFs) were analyzed by the immunoblots. Soluble APPa and sAPPs (sAPPa and sAPPb) were detected by 6E10 and 22C11 monoclonal antibodies. CTFa was detected by the A8717 antibody. • (B)The densitometry data were calculated for the ratios. BACE inhibitor IV (5 μM) • Butanol extract of E. cava prevents Aβ secretion via β-secretase inhibition.

12. - β-amyloid fibril에 비하여 oligomer가 5배 이상의 독성을 가짐 - Aβ1-42만이 이와같은 oligomer형태를 이룸 - Aβ1-42 알츠하이머병의 새로운 표적으로 떠오름.

13. Butanol extract of E. cava prevents Aβ secretion - HEK293-APPsw stable cells were treated with various concentrations of butanol extract of E. cava for 8 h. - The concentrations of Aβ1–40 and Aβ1–42 in the culture media were assayed by ELISA methods after the treatment of the butanol extract.

14. Butanol extract of E. cava inhibits Aβ oligomerization (a)The butanol extract was incubated with 10 μM Aβ1–42 solution for 18 h at 4oC to determine the effect on low-size (monomer to tetramer) Aβ oligomerization. (b) The butanol extract was incubated with 10 μM Aβ1–42 for 18 h at room temperature to determine the effect on middle-size (40–120 kDa, particularly around 50 kDa) Aβ oligomerization. (c and d) TEM images of middle size Aβ oligomer (untreated control, c) and of the co-treatment of 50 μM butanol extract with Aβ (d) are shown. In Fig. 2c, large globular aggregates (white arrowhead) were shown, but not in Fig. 2d, only small aggregates were shown. 100 nm

15. Butanol extract of E. cava inhibits Aβ fibrillogenesis (black bar = 200 nm) • Congo red assay was performed after 7 days of incubation without and with the increasing amount of butanol extract co-incubated with 100 μM Aβ1–42 (measuring of β-sheet structure) • (b) Thioflavin T assay results • Transmission electron microscopy images of the Aβ fibril preparation(untreated control, c) • and of the Aβ fibril preparation treated with 50 μM butanol extract (d) are shown.

16. Butanol extract of E. cava inhibits Aβ-induced cell death (Primary rat cortical Neurons) β-amyloid를 10μM로 처리 (A) MTT assay (B)LDA release

17. Schematic illustration of the pathogenesis by beta-amyloid and its aggregates Butanol extract of E. cava inhibits Aβ synthesis via BACE inhibition and reduces Aβ oligomerization and further fibrilization. Ultimately, the extract prevents Aβ-induced neuronal cell death.

18. TLC chromatogram of the subfractions obtained from E. cava butanolfraction (silica open column) E6 E1 E2 E3 E4 E5 E7

19. BtOH fr. E1 E2 E3 E4 E5 E6

20. Aβ1-42 inhibition of sub fractions of E. cava butanol fraction

21. TLC chromatogram of the subfractions of E. cava E5 (sephadex open column)

22. BtOH fr. E5 E5-4 E5-5 E5-6 E5-7 E5-8 E5-9

23. Aβ1-42 inhibition of sub fractions of E. cava E5

24. 1H, 13C NMR and maldi-tof mass spectrum 1H NMR spectrum of E5-9 compound 13C NMR spectrum of E5-9 compound 1H, 13C NMR and maldi-tof mass data of E5-9 compound in DMSO-d6 Maldi-tof mass spectrum of E5-9 compound

25. Chemical structure of E5-9 compound 4’ A 1’ 1 15a 13 B C 12a 3 5a 4a 6 11a 7 1’’ Phlorofucofuroeckol A D E 4’’ 11 9

26. 혈관성치매 연구를 위한 뇌세포연구 저빌에서 뇌허혈 유발 Cryosection 30 ㎛ 크레실 바이올렛 Fluoro-jade B염색

27. Cresyl violet staining in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia .

28. Relative analysis as a percentage in the number of Cresyl Violet+ neurons

29. NeuN immunohistochemistry NeuN immunohistochemistry in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.

30. Relative analysis as a percentage in the number of NeuN+ neurons Relative analysis as a percentage in the number of NeuN+ neurons in the sham, vehicle-, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.

31. Fluoro-Jade B histofluorescence Fluoro-Jade B histofluorescence in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.

32. 미세아교세포 활성화 억제 정상군: 세포질이 작고 돌기가 발달하지 않은 휴지형 미세아교세포 관찰 뇌허혈 유발군: 세포질 및 돌기가 발달한 미세아교세포 뿐만 아니라 아메바형 미세아교세포 또한 다수 관찰. 미세아교세포 활성화 억제가 신경세포 보호와 밀접한 연관성이 있음 Iba-1 immunohistochemistry in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.

33. 후보 물질의 분리, 정제 및 구조분석 Fig. 구멍쇠미역 EtOAc 분획물의 TLC 사진. Table. 구멍쇠미역 EtOAc 분획물의 silica chromatography 분리 후,활성검사(50 μg/mL)

34. 후보 물질의 분리, 정제 및 구조분석 Fig. 구멍쇠미역 효능 물질의 QTOF-MS를 이용한 분자량 분석(m/z: 498.93) Table 구멍쇠미역 효능성분의 1H 및 13C NMR spectrum (in CDCl3) 정제된 효능 물질의 분자량 및 구조는 Q-TOF-MS 및 NMR을 이용. 구멍쇠미역 주요 효능 물질의 분자량은 498.93으로 측정되었으며, C24H16O12의 분자구조를 가짐

35. Chemical structure of keycompound (Tetraphloroethol E) Fig. 구멍쇠미역 기능물질/지표물질의 구조

36. 단기 기억력: Passive avoidance Test Avoidance latency (sec) a a b c group Effect of Phlorofucofuroeckol (E6) and tetraphloroethol E (E13) on the memory deficit mice induced by scopolamine in the passive avoidance performance test (50 μg/kg)

37. 공간학습능력: Morris water maze Stop-through latency (sec) a a Frequency b b b bc c c group group Effect of Phlorofucofuroeckol (E6) and tetraphloroethol E (E13) on the memory deficit mice induced by scopolamine on the stop-through latency and frequency (50 μg/kg 100sec)

38. 기능성 원료 표준화 및 기준규격설정 • 표준화 필요성 • 일정한 효과(활성)를 함유한 원료 생산 • 유효성분 함량이 가능한 높은 원료 생산 • 원료의 수율 최적화 공정 확립 • 기준규격에 적합한 원료의 안정적 생산 원재료표준화 제조공정표준화 지표성분설정 기능성평가 • 물질 분리 및 정제 • - 용매분획 • Column 분리 • 단일화합물 • 기능/지표 성분 • 설정 • 추출 • 용매, 온도, 시간 등 • 농축 • 온도, 압력, 시간 등 • 건조 • 건조(VD, FD, SD 등) • 분말 • 안전성(독성)평가 • 시험관 및 • 동물시험 • 인체적용시험 • 식물 종 • 확보량 • 사용부위 • 채취시기 • 원산지

39. 과립화 분말/캡슐화 액상 소재화 제조공정표준화 원료 제형 시제품 개발 감태/구멍쇠미역

40. 제조공정 표준화

41. 제조공정 표준화

42. 액상 소재화 공정 1) not detected, 2) 변화 없음

43. 분말 소재화 공정

44. 감사합니다.