项目：生物工程下游技术综合性实验 —— 柠檬酸的生产

项目：生物工程下游技术综合性实验——柠檬酸的生产项目：生物工程下游技术综合性实验——柠檬酸的生产

1.教学目标 • 1.1 知识目标： • 1）掌握柠檬酸发酵生产的原理 • 2）掌握真菌深层液体发酵生产工艺 • 3）掌握钙盐沉淀法提取柠檬酸的原理及方法 • 4）熟悉柠檬酸的纯化方法

1.2 能力目标： • 1）综合运用所学专业知识完成一种生物技术产品的生产。 • 2）通过查询、收集、整理信息，制定出实验方案，锻炼主动分析问题、解决问题的能力。 • 3）提高团队协作能力。

2.柠檬酸（Citric acid)简介 • 2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸 • C6H8O7 192.14 • 理化性质：白色结晶粉末，无臭，酸性强。熔点153℃，沸点175℃。溶于水、乙醇、丙酮，不溶于乙醚、苯，微溶于氯仿。 • 用途：1、食品行业（70%）：酸性调味剂、防腐剂。 • 2、医药、化妆品（10%）：药品合成的原料 • 3、化工（15%）：原料，如其酯类做无毒增塑剂 • 4、其他（5%）

生产情况： • 目前柠檬酸世界消耗量120万吨，年产能160万吨。中国的年产能80万吨，是最大的柠檬酸生产国和出口国。 • 生产方法： • 水果提取法 • 化学合成法 • 发酵法（固态发酵法、液体浅盘发酵、深层通风发酵）

3 柠檬酸生产的原理 • 3.1原料：理论上凡是能被微生物代谢并分泌积累大量柠檬酸的物质都可作为柠檬酸的发酵原料，分糖质原料和石油烷烃原料。糖蜜

葡萄糖 3.2 柠檬酸发酵的原理 EMP

3.3 生产菌黑曲霉Aspergillus niger 真菌中的一个常见种，半知菌亚门，半知菌纲，壳霉目，杯霉科。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。好氧菌，生长适温37℃，无性繁殖，孢子在培养基中6-8h出芽，一个生活周期约50h。乌头酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶活性低，而柠檬酸合成酶的活性高，利于大量积累柠檬酸。

黑曲霉发酵的特点：

4 柠檬酸生产的过程 4.1 柠檬酸生产的工艺流程：斜面种子原料液化发酵压滤柠檬酸钙柠檬酸纯化空压机空气净化系统碳酸钙硫酸

4.2 生产步骤 • 4.2.1预备实验 • 1）斜面培养基制备 • 2）菌种活化：将长期保存的菌种接入斜面培养基活化培养一次，35℃培养3~4天至长出大量黑色孢子。 • 4.2.2种子制备 • 1）种子培养基制备：1-2%小麦粉糖化液，0.2%硝酸铵，pH自然，三角瓶分装后于121℃灭菌30min。 • 2）制备孢子悬液：向每支菌种斜面中加入5 mL无菌水，用接种环刮下孢子制成孢子悬液。 • 3）接种与发酵：将孢子悬液接入到已灭菌的种子培养基中，于35℃、250r.p.m，发酵3~5d。 • 观察菌体生长情况，待溶度达60-150万/mL，菌丝球为致密形，直径<0.1mm，菌丝短粗，分支少，瘤状突出为优。

4.2 生产步骤 • 4.2.3 发酵培养 • 1）空罐灭菌 • 2）发酵培养基制备：小麦粉液化，营养盐添加，灭菌 • 3）接种 • 4）发酵参数设置 • 5）发酵条件控制：温度28-30 ℃，生物量12-20%，严防缺氧

思考题： • 1、为什么要在培养基中加铵盐？ • 2、影响柠檬酸发酵的因素有哪些？

4.3影响柠檬酸发酵的因素 • 1）通氧量与产酸量 • 2）菌球形态:小而致密、空心状 • 3）无机盐：缺Fe是柠檬酸生成的必要条件，且是在磷、锌、锰充裕下表现出。

项目：生物工程下游技术综合性实验 —— 柠檬酸的生产

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