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BSA 毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用

BSA 毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用. 02化工专业： 伍品端 指导老师 ： 马志玲 副教授. 目录. Ⅰ.研究意义和研究现状 Ⅱ.实验部分 Ⅲ.结果与讨论 Ⅳ.实验创新点. Ⅰ.研究意义和研究现状. 手性分离的重要性 生物大分子几乎都具有 “ 手性 ” 特征。 手性 药物各对映体的药效学等可能存在很大的差异 。 因而评价手性药物各对映体的生物学活性,建立快速、准确、灵敏的 对映体拆分 方法具有十分重要的意义。. Ⅰ.研究意义和研究现状. 拆分对映体的 色谱技术 ： 高效液相色谱 高效毛细管电泳 超临界流体色谱 ……. 毛细管区带电泳

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BSA 毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用

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Presentation Transcript

  1. BSA毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用 02化工专业： 伍品端 指导老师 ： 马志玲 副教授

  2. 目录 • Ⅰ.研究意义和研究现状 • Ⅱ.实验部分 • Ⅲ.结果与讨论 • Ⅳ.实验创新点

  3. Ⅰ.研究意义和研究现状 • 手性分离的重要性 • 生物大分子几乎都具有“手性”特征。手性药物各对映体的药效学等可能存在很大的差异 。 • 因而评价手性药物各对映体的生物学活性,建立快速、准确、灵敏的对映体拆分方法具有十分重要的意义。

  4. Ⅰ.研究意义和研究现状 • 拆分对映体的色谱技术： • 高效液相色谱 • 高效毛细管电泳 • 超临界流体色谱 …… 毛细管区带电泳 胶束电动色谱 毛细管电色谱（CEC）(以电渗流为驱动力的微柱液相色谱技术) …… 对映体分离机理： 手性选择剂与对映体主要为疏水和静电作用，只有具备特定空间构形和化学官能团的分子才能与这一区域结合 。

  5. Ⅰ.研究意义和研究现状 • CEC的优点： CE CEC LC 高效性 高选择性多功能性 高效性、高选择性、多功能性

  6. Ⅰ.研究意义和研究现状 • 手性引入方法 • 柱前手性衍生化法 • 手性流动相添加剂法 • 手性固定相法 √ 常用CEC手性选择剂 人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素蛋白、卵类粘蛋白、α-酸性糖蛋白等。

  7. Ⅰ.研究意义和研究现状 总之，CEC以样品与固定相之间的相互作用为分离机理，以电渗流为流动相驱动力。不仅具有CE水平的高柱效，而且具有HPLC水平的高选择性。 而且，CEC整体柱在手性分离中也显示出一定优势。 返回

  8. Ⅱ.实验部分 1.仪器和试剂（略） 2.实验方法 用动态法在聚合整体柱基质上键合BSA蛋白 毛细管处理 使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离 在毛细管内聚合整体柱基质

  9. 二、在毛细管内合成整体柱 单体 交联剂 返回

  10. 三、键合BSA蛋白 Epoxy method 返回

  11. 分离对象：D,L－组氨酸 分离条件： 运行缓冲溶液：2mM磷酸盐缓冲液 分离电压：＋6kV 检测方法： 电导检测 四、使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离。 返回

  12. Ⅲ.实验结果与讨论 一、整体柱基质聚合条件的优化 二、整体柱分离D,L-组氨酸对映体

  13. 整体柱基质聚合条件的优化 • 活性基团——IR • 渗透性——背压 • 孔结构——SEM、氮吸附法 最佳聚合条件 表1 整体柱各性能的影响因素

  14. 环氧活性基团——IR 环氧基和酯基分别在约910cm-1和1730cm-1处有吸收。 图1 整体柱基质的红外光谱图

  15. 单体含量对整体柱活性基团含量的影响 固定致孔剂和溶剂的含量，改变单体（ ）和交联剂（ ）相对含量，用红外光谱法比较环氧基吸收峰（约910cm-1）和酯基吸收峰（约1729cm-1）峰面积。 表2 环氧基与酯基峰面积比较 返回

  16. 1.交联剂含量对整体柱背压的影响 表3 不同交联剂含量的整体柱基质背压 原因：随着交联剂用量的减少，相分离提前，使孔径 增大。

  17. 2.致孔剂含量对整体柱背压的影响 随着致孔剂（非良性溶剂）用量增大，相分离提前，孔径增大。 图2 不同致孔剂含量整体柱基质背压 返回

  18. 表4 整体柱基质组成 孔结构——SEM 图3 K1#（50%致孔剂）SEM图 图4 K5#（10%致孔剂）SEM图

  19. 孔结构——氮吸附法 该整体柱基质的孔都是中孔和大孔，孔径分布在50nm-90nm范围内最多。 图5 K1#（50％致孔剂）孔径分布图 返回

  20. 整体柱基质聚合条件 单体: 24% 交联剂: 16% 致孔剂: 50% 溶剂: 10 % 返回

  21. CEC分离组氨酸对映体结果 在＋6.0kV的分离电压下，以2mmol·L－1，pH＝5.5磷酸盐缓冲溶液作运行液 ，分离D,L-组氨酸，所得CEC图。 图6 D,L-组氨酸CEC图

  22. 表5 缓冲液的pH值对分离效果的影响 结论 缓冲液作运行液的pH值越高 ，BSA （pI=4.7）离解的负电荷越多，使正的电渗流越强，使保留时间越早。 较高pH值的缓冲液作运行液时分离度下降是由于，正的电渗流较强，待分离对映体与手性选择剂的作用来不及很好地进行，就被带出毛细管。 返回

  23. Ⅳ实验创新点 • 通过条件实验，用IR、测定背压、SEM和氮吸附法等方法，确定出最佳聚合条件，成功制备出毛细管电色谱柱。 • 首次建立了采用IR法定性和定量分析整体柱基质表面的活性基团。 • 最简便的方法（环氧基法），用BSA蛋白对毛细管整体柱进行修饰，制成手性毛细管电色谱柱。 • 用手性毛细管电色谱柱分离组氨酸对映体，并考察了运行缓冲液pH值对柱效及分离度的影响,并从原理上作出解释。

  24. 前景展望 • 目前，CEC在药物分析方面已有广泛的研究，集中在与药物相关的杂质分离和手性药物的分离等。 • 随着毛细管电色谱技术的不断完善和提高，将在生物技术、环境保护、农业化学、精细化工产品、食品工业等多个领域的分析中得到应用。 • 在可预计的将来，CEC作为一种发展中的快速分离技术，将有更广泛的应用前景。

  25. 致谢 • 感谢创新化学实验与研究基金项目 • 感谢导师马志玲副教授的悉心指导 • 感谢凌连生、谢天尧、曾锋、邹世春等老师的关心和帮助 • 感谢师兄师姐和朋友们对我的鼓励和帮助

  26. 谢谢！

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