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第十四章 基因工程常用技术

第十四章 基因工程常用技术. 教学目的和要求. 1. 了解基因工程常用技术 2. 掌握细菌的转化和转染 3. 理解定点突变的诱发因素 4. 掌握核酸分子杂交 5. 理解 PCR 技术 6. 理解 DNA 序列分析方法 7. 了解基因组文库的构建方法. 基因工程常用技术. ① 凝胶电泳 ② 细菌的转化和转染 ③ 核酸分子杂交 ④ 定点突变 ⑤ PCR ⑥RFLP ⑦RAPD ⑧DNA 序列分析 ⑨ 目的基因的分离和转基因植物、转基因动物等技术。. 凝胶电泳：

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第十四章 基因工程常用技术

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Presentation Transcript

  1. 第十四章 基因工程常用技术

  2. 教学目的和要求 1. 了解基因工程常用技术 2. 掌握细菌的转化和转染 3. 理解定点突变的诱发因素 4. 掌握核酸分子杂交 5. 理解PCR技术 6. 理解DNA序列分析方法 7. 了解基因组文库的构建方法

  3. 基因工程常用技术 ①凝胶电泳 ②细菌的转化和转染 ③核酸分子杂交 ④定点突变 ⑤PCR ⑥RFLP ⑦RAPD ⑧DNA序列分析 ⑨目的基因的分离和转基因植物、转基因动物等技术。

  4. 凝胶电泳： 分辨DNA范围 使用浓度 琼脂糖凝胶 几百-2万bp 0.3-2.0% 聚丙烯酰胺凝胶 6-1000bp 3-20% 凝胶电泳制备方法： 样品制备→凝胶制备→电泳→染色→观察。应用于分析；纯化。

  5. 细菌的转化和转染 转化：指受体细胞从周围介质总共吸收外来DNA片段，使其基因型和表型发生相应变化 转染：转化的特殊形式，是用离体状态的噬菌体、病毒核酸感染细胞，以改变受体遗传组成 • 关键：①受体细胞是否处于感受态。诱导方法为：快速生长的细菌+0℃、CaCl2低渗溶液→细胞肿胀呈球状（感受态）+DNA→吸附+42℃短暂处理+MgCl2→吸收②为防止限制，提高转化效率，可选用无限制作用的突变体。

  6. 定点突变的诱发 • 这项技术是加拿大的M.Smith70年代创造，获1993年诺贝尔化学奖。 • 也称位点专一诱变。是一种反向遗传学方法。即将克隆基因在体外按预先的设计利用核酸酶、诱变剂等来诱发位点特异性突变，或将预先确定的碱基改变引入人工合成的寡核苷酸再组入基因中，然后将已知缺失、插入、碱基替换、移码等不同类型的突变基因导入受体细胞，再进行选择、分析突变表型。 • 这里仅介绍寡核苷酸定点突变

  7. 寡核苷酸定点突变 原理及步骤

  8. 核酸分子杂交 • 1968年由Boy Britten等人发明 • 原理：DNA或RNA（带互补的特定核苷酸序列）→混合（退火）→同源区段形成双链结构→杂种核酸分子（来源不同） • 类型：Southern杂交；Northern杂交；原位杂交（boltting） • Southern杂交：将电泳凝胶中的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同DNA或RNA探针杂交检测同源片段的方法。见图

  9. Southern杂交 图.Southern转移和分子杂交的过程

  10. Northern杂交 • 又称RNA印迹技术，是将RNA分子从电泳凝胶转移到NC滤膜上进行杂交的一项技术。 • 由J.C.Alwinex等在1979年建立 • 它与Southern杂交十分相似，不同之处只是从凝胶中转移到滤膜的是RNA而不是DNA • 类似的转移蛋白质的方法叫Western杂交 • 应用Northern杂交技术可以了解特定基因的表达情况。

  11. 原位杂交 • 在Southern杂交技术的基础上发展起来的 • 菌落（或噬菌斑）杂交，其方法是将培养皿中的菌落印迹到NC滤膜上，溶菌，使变性的DNA与滤膜牢固结合。然后按照Southern杂交的方法进行分子杂交和显影。常用于目的克隆（菌落）的筛选。（见下图） • 细胞和组织的原位杂交首先要制备组织样品，步骤包括组织固定、脱水、石蜡包埋和切片。转移至滤膜并在原位进行杂交，放射性同位素标记的DNA或RNA探针与待测DNA的互补配部位，可通过放射性自显影显示出来。

  12. PCR技术 • PCR：polymerase chain reaction的缩写 • 叫做聚合酶链式反应技术 • 1985年，美国Kerry Mullis发明 • 荣获1993年诺贝尔化学奖 • 原理：引物延伸反应产生的子链DNA经热变性为单链后，有可作为模板，在引物和DNA聚合酶的作用下指导新的子链的合成。 • 需要：引物（一对）；酶（如TagDNA聚合酶）；dNTP ；缓冲液；水（超纯水）

  13. PCR扩增的几个方面 • 关于扩增参数：①启动温度②循环 “变性”（94℃；30′）→“退火”（温度由引物确定；30′）→“延伸”（72℃；时间由扩增的长度而定）。注：退火温度[±4×(G+C)+2(A+T)]③循环次数 25~30次④最后延伸时间要长一些。 • 优点和问题：可对痕量DNA进行大量扩增。TagDNA聚合酶复制忠实性差，错误掺入率为2×10-4，30轮后可达0.25%，比Klenow酶高4倍。 • 应用 ①gene扩增②探针制备③临床④法医学

  14. RFLP和RAPD技术 • RFLP：限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism） • DNA分子（来源不同）；基因组DNA（不同生物）→长度不同的限制性片段。对于一种酶和一种DNA来说，所产生的限制性片段都是特异的，所以，这些片段的电泳图谱可以作为这种DNA的“指纹”，故又叫指纹分析。 • RAPD：随机扩增多态性，用于DNA“个性” • DNA样品→PCR扩增→得到一组数目及长度不同的DNA片段→电泳，EB染色→电泳图谱

  15. DNA序列分析 • Maxam-Gilbert和W.Gilbert建立 • 基本原理：DNA片段（末端带有放射性标记）→特定位点断裂→一组长度不同的片段→电泳自显影X光片上显示谱带→读出DNA碱基顺序。 • 步骤：化学降解时，将DNA样品分为四份，放入不同的反应系统中。见下图

  16. 双脱氧-M13体系DNA序列分析法 • 待测片段克隆到M13载体上，其优点①制备足够的DNA片段②使用一种通用引物③M13复制产生的单链DNA释放到细胞外。

  17. 目的基因的分离 • 通常是先建立基因文库，然后从基因文库中筛选和鉴定含目的基因的克隆。 • 基因文库（gene library）：是指含有插入片段的重组体DNA分子的一个集合体，这些分子加在一起就构成了一个生物体的整个基因组。

  18. （一）基因组文库的建立 • cDNA文库：从某一生物或特定器官和组织中获得的总DNA，经反转录产生cDNA，以cDNA构建的克隆群体就叫这种生物（或器官和组织）的cDNA文库。 • 主要优点：⑴筛选目的基因较容易，因为一个完全cDNA基因文库所含的克隆数，比一个完全的基因组DNA文库所含的克隆数要少的多⑵cDNA克隆中不存在内含子序列，这有利于在原核细胞中表达。

  19. （二）基因组文库（genome bank） 基因组文库即gDNA文库，是指包含某种生物的基因组全部DNA的基因文库。哺乳类的基因文库多用λ 噬菌体构建，计算得到的噬菌斑数目可确定基因文库是否包括了99%的基因组DNA。 基因组文库大小：N=㏑（1-p）/㏑（1-f） N：所需的重组体数目； p：是从一个基因文库中分离得到的单拷贝基因的 概率； f：是外源DNA片段平均大小占整个基因组长度的 百分数。 该公式还可简化为N=4.61×G/f，其中G是基因组的大小

  20. 本章小结 1.基因工程常用技术 凝胶电泳、细菌的转化和转染、核酸分子杂交、定点突变、PCR、RFLP、RAPD、DNA序列分析、目的基因的分离和转基因植物转基因动物等技术 2.细菌的转化和转染 3.定点突变的诱发 4.核酸分子杂交 Southern杂交、 Northern杂交、原位杂交 5. DNA序列分析 双脱氧-M13体系DNA序列分析法 6.基因组文库的建立

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