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第 14 章 分枝杆菌、 放线菌与诺卡菌

第 14 章 分枝杆菌、 放线菌与诺卡菌. 概 述. 分枝杆菌与放线菌属放线菌目（ Actinomycetates ） 分枝杆菌属（ Mycobacterium ） 是一类细长略带弯曲专性需氧性杆菌。该菌一般认为革兰染色阳性。多数细菌在生长的一定时期抵抗酸 - 醇（ acid-alcohol-fast ），故又称 抗酸杆菌（ acid-fast bacillus ）. 概 述. 放线菌（ Actinomyces ）是一群在生物学特性上与细菌类同的原核细胞型微生物，与分枝杆菌、棒状杆菌等有着亲缘关系放线菌是多数不致病 . 对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属 :

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第 14 章 分枝杆菌、 放线菌与诺卡菌

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  1. 第14章 分枝杆菌、放线菌与诺卡菌

  2. 概 述 • 分枝杆菌与放线菌属放线菌目（Actinomycetates） • 分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长略带弯曲专性需氧性杆菌。该菌一般认为革兰染色阳性。多数细菌在生长的一定时期抵抗酸-醇（acid-alcohol-fast），故又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus）

  3. 概 述 • 放线菌（Actinomyces）是一群在生物学特性上与细菌类同的原核细胞型微生物，与分枝杆菌、棒状杆菌等有着亲缘关系放线菌是多数不致病. 对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属: • 前者为厌氧或微需氧菌，细胞壁中不含分枝菌酸，多引起内源性感染。 • 后者为需氧菌，细胞壁中含有分枝菌酸，非人体正常菌群的成员，常引起外源性感染。

  4. 放线菌与诺卡菌的区别

  5. 第一节 结核分枝杆菌 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB） • 简称结核杆菌 • 人和动物结核病的病原菌

  6. 一、分 类 MTB包括 人结核分枝杆菌（M.tuberculosis） 牛分枝杆菌（M.bovis） 非洲分枝杆菌（M.africanum） 坎纳分枝杆菌（M.canettii） 田鼠分枝杆菌(M.microti)等 • 前四种对人类致病，其中人型MTB感染率最高

  7. 二、临床意义 • 大约1/3的人口已感染MTB • 有2000万活动性结核病患者 • 每年新发病900万人，死于结核病300万人 • 近年来，AIDS的发病率上升，AIDS患者又极易患结核病，结核病已成为威胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题

  8. 二、临床意义 • WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手

  9. 二、临床意义 (一) 所致疾病 通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径，感 染机体，引起多种脏器的结核病，其中以肺结核为 多见 (二)免疫性 有菌免疫或称传染性免疫 细胞免疫 迟发型超敏反应

  10. 二、临床意义 (三) 变异 • 结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒力以及耐药性的变异 • 卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株 • 现已广泛用于人类结核病的防治

  11. 二、临床意义 (四)耐药性 • 对常见抗菌药物天然耐药 • 多重耐药结核病(multiple-drug resistance tuberculosis，MDRTB)是指对2种或2种以上的抗结核药产生耐药性的结核菌感染。临床治疗相当棘手，死亡率很高

  12. 三、微生物学检验 基本特性 结核分枝杆菌尚未发现产生内毒素、外毒素及侵袭 性酶。致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引 起的炎症、代谢物质的毒性以及菌体成分引起的免 疫损伤有关。 结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂质和蛋白 质

  13. 三、微生物学检验 （二）标本采集 • 据感染部位的不同采集不同的标本 • 疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检 • 疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通常需3～5份标本） • 采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检 • 其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养

  14. 三、微生物学检验 • 齐-尼染色（Ziehl-Neelsen technique）是常用的抗酸染色法，染色后结核分枝杆菌呈红色，背景呈蓝色

  15. 形态学检查 • 用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下菌体呈橘黄色

  16. 涂片镜检的报告方式

  17. 核酸检测 • 用PCR法快速诊断MTB感染 • PCR法检测DNA特异性更强，敏感性更高 • PCR须按法规要求规范操作，应防止标本污染出现假性结果

  18. 三、微生物学检验 （四）分离培养与鉴定 • 培养特性 • 专性需氧，3％～5％CO2能促进其生长 • 最适生长温度为35～37℃，最适pH6.5～6.8 • 14～18h分裂1次，生长缓慢，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落 • 典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样

  19. 2.分离培养 营养要求高:须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及 含某些无机盐类的特殊培养基上才能生长良好。常用 罗氏培养基 标本接种于选择性培养基中(常用罗氏，所含的孔雀 绿或青霉素可抑制杂菌生长) • 37℃，5％～10％CO2，培养8周 • 结核杆菌出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落 • 涂片染色为抗酸阳性

  20. 淡黄色 灰白色

  21. 生化反应--烦琐、费时（ 4～8 周）,影响因素多 • 结核分枝杆菌不发酵糖类 • 能产生触酶 • 人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能 • 人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无毒株则为阴性，并失去索状生长现象

  22. 噬菌体鉴定法（PhaB） • Wilson 等于1997年建立的快速检测新技术 • 原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分枝杆菌,未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活 ,已进入菌体内的噬菌体不受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖 ,并将菌体裂解 ,释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞 ,并将其裂解 ,在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。

  23. 分子生物法菌种鉴定 • PCR 限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP） • PCR单链构象多态性分析（PCR-SSCP） • 核酸探针 • 核酸序列分析 • 多重PCR

  24. 高效液相色谱（HPLC） • 检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。

  25. 三、微生物学检验 （五） 免疫学诊断 1．结核菌素试验 2．结核分枝杆菌抗原检测 3. 结核分枝杆菌抗体检测 4. 全血干扰素测定法

  26. 结核菌素试验 • 针对旧结核菌素(OT)与结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)两种菌体蛋白 • 原理：当将蛋白注入皮内后，如受试者已感染结核杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏反应性炎症，若受试者未感染MTB则无反应。

  27. 结核分枝杆菌抗原检测 • 用ELISA 方法在血清中检测结核分枝杆菌抗原-结核菌外分泌特异性抗原 (external secreted specific antigen) 浓度。 • 任何体液如血液、痰液、脊髓液、尿液和各式组织萃取液等体液可用于检测特异蛋白抗原。

  28. 结核抗体检测 • 作为活动性MTB感染的快速诊断方法之一 • 比传统的痰涂片抗酸染色、MTB培养等方法简便、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。 • 近年，胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体抗体，特别是后者，针对三种抗原（脂阿拉伯甘露糖、38K Da和16K Da蛋白质抗原），其灵敏度和特异性均有所提高。

  29. 全血干扰素测定法 • 原理：当全血与PPD和对照抗原（植物血凝素）共同孵育后，致敏的淋巴细胞可分泌IFN-γ，通过检测IFN-γ的含量来鉴定菌种。 • 用于诊断活动性结核病，准确、灵敏、特异、快速。 • 结果与结核菌素试验相当，干扰因素小。

  30. 第二节 非结核分枝杆菌

  31. 一、概述与分类 非结核分枝杆菌（Ｎontuberculosis Mycobactericum，NTM）: 指结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分枝杆菌和田鼠分枝杆菌) 和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。

  32. 二、临床意义 • 迄今为止已发现NTM有150余种，其中约1/3与人类疾病有关。 条件致病菌 毒力低于结核分枝杆菌 自然界中广泛存在 可以在人体某些部位定植 • 结核病和NTM感染的治疗不同

  33. 三、微生物学检验 （一）标本采集 见结核杆菌部分 （二）涂片抗酸染色 本菌为抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短而粗，大小约1～8µm×0.3～0.5µm，抗酸染色着色均匀，呈束状或团状排列 （三）分离培养与鉴定

  34. 三、微生物学检验 （四）其他鉴定方法 • NTM非培养方法的鉴定与结核分枝杆菌类似，可参考结核杆菌部分。 • NTM的实验室诊断可跟据细菌生长速度、色素等表型特征进行初步鉴定，再进行分子诊断，后者应用越来越广泛。

  35. 第三节 麻风分枝杆菌 麻风病的病原菌，麻风是一种慢性传染病，主要表现为皮肤、黏膜和神经末梢的损害。晚期可侵犯深部组织和器官，形成肉芽肿。 根据临床表现、免疫病理变化和细菌检查结果等将麻风分为瘤型、结核样型和界限类综合征等三种病型。

  36. 麻风分枝杆菌（M.leprae） • 麻风病的病原菌 • 1873年挪威学者Armauer Hansen从麻风患者皮肤结节中发现，又名Hansen杆菌。 • 革兰染色阳性 • 具有抗酸性

  37. 一、临床意义 • WHO自1995年始对麻风患者实施免费治疗 • 麻风病发病率直线下降 • 2008年全球新发现麻风患者249000例 • 中国现症麻风病患者由解放初期的50多万人减少至目前的6000余人 • 2001～2008年,我国每年新发现患者1400～1700例

  38. 二、微生物学检验 （一）基本特性 • 本菌为抗酸杆菌，较结核分枝杆菌短而粗，大小约1～8µm×0.3～0.5µm，抗酸染色着色均匀，呈束状或团状排列。 • 麻风分枝杆菌为典型的胞内寄生菌，有麻风分枝杆菌存在的细胞胞浆呈泡沫状，称为麻风细胞。 • 用药后细菌可断裂为颗粒状、链杆状等，着色不均匀，叫做不完整菌。 • 革兰染色阳性，无鞭毛、无荚膜、无芽胞。

  39. 二、微生物学检验 （二）标本采集 通常自眶上、颧下、下颌、耳廓及鼻腔黏膜等数处采取标本

  40. 二、微生物学检验 （三）标本直接检查 1.显微镜检查 • 用刀刮取组织液做涂片，火焰固定，抗酸染色、镜检，麻风分枝杆菌呈红色，细胞呈蓝色。金胺“O”染色、荧光显微镜检查，可提高阳性率 • 麻风分枝杆菌多呈束状或成团聚集，结核分枝杆菌多散在，偶有聚集。麻风分枝杆菌菌体粗直，两端尖细，而结核分枝杆菌则细长略弯曲，且有分枝现象。在镜下可见大量麻风细胞。 2.活组织切片 抗酸染色及病理学检查。

  41. 二、微生物学检验 （四）其他诊断方法 • 该菌目前尚不能人工培养 • 近年采用PCR技术检测麻风菌基因、运用新发现抗原血清学与T细胞试验可以对麻风病进行早期诊断。

  42. 第四节 放线菌属 • 放线菌（Actinomyces）能引起牛和人的疾病 • 1891年，Wolff和Israel应用厌氧培养法，首先将人型放线菌培养成功。 • 因菌落生长呈放射状而得名。

  43. 一、分 类 • 放线菌是引起人放线菌病（Actinomycosis）的病原菌，属于内源性感染。 • 目前发现衣氏放线菌（A.israelii）、内氏放线菌（A.naeslundii）粘放线菌(A.viscous)、龋齿放线菌（A.odontolyticus）及丙酸蛛网菌。（Arachniapropionica）5种可引起人的放线菌病. • 其中衣氏放线菌最多见。 • 牛型放线菌（A.bovis）是本属的典型菌种，主要引起牛的放线菌病。

  44. 二、临床意义 放线菌：口腔，呼吸道，胃肠道和泌尿生殖道与外界相通腔道的正常菌群。 所致疾病： 1.内源性感染(放线菌病)：软组织肉芽肿性炎症(慢性,无痛,多发性瘘管,排出硫磺样颗粒。) 2.龋齿和牙周炎

  45. 三、微生物学检验 （一）基本特性 • G+、非抗酸性丝状菌 • 培养困难，厌氧或微需氧 • 硫磺样颗粒（菌落） 压片或组织切片，显微镜下可见颗粒呈菊花状。

  46. 硫磺样颗粒(sulfur granule)

  47. 三、微生物学检验 （二）分离培养 培养：厌氧或微需氧 气体环境：5％ CO2 营养培养基：脑心浸液琼脂平板 温度与时间：37℃，24～48h 菌落:灰白色蜘蛛状、不规则结节状或臼齿状菌落, 初分离(粗糙) 生化特性:溶血(-) 葡萄糖(+) 甘露醇(+) 吲哚(-) 触酶试验(-)【黏液放线菌除外】

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