Sequenciamento de DNA em MegaBACE DNA Analysis Systems

1. TGTGAACACACGTGTGGATTGG... Sequenciamento de DNA em MegaBACE DNA Analysis Systems • Prof. Dr. Luciano da Silva Pinto ls_pinto@hotmail.com

2. Sequenciamento do DNA • Definição • Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA. • Importância • O conhecimento da seqüência de bases de um gene fornece importantes informações sobre sua estrutura, função e relação evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes).

6. Análise do fluxo da informação celular pela pesquisa genômica

7. Histórico – O sequenciamento de DNA no tempo Watson & Crick Nobel 1962

8. Histórico – O sequenciamento de DNA no tempo Frederick Sanger Prêmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980 J. Mol. Biol. v.94, p. 441-448, 1975 Walter Gilbert Prêmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980 PNAS, vol. 74 No. 2 p. 560-564, 1977

9. Seqüenciamento de DNA Projeto Genoma Humano

10. Tecnologias de sequenciamento • Maxam & Gilbert, método químico- 1972 • Sanger sequencing • PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467 • Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas) • Pirosequenciamento • Science 281 (1998), n. 5375, 363-365 • Nature 437 (2005), 362-7 • Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)

11. Método de Sanger • Reação de seqüenciamento • amplificação linear • Eletroforese em gel de acrilamida • em placa • capilar • Leitura da seqüencia • manual • automática

12. OH H Reação de seqüenciamento • fragmento de DNA (fita simples) • 1 primer • DNA polimerase • dNTPs • ddNTPs

14. Eletroforese • em placa • capilar

15. Reação de sequenciamento e marcação do DNA Leitura das sequências -Automática Leitura das sequências -Manual Radioisótopos Fluoresceínas

16. G A T C Leitura da seqüência de DNA • Manual

17. Leitura da seqüência de DNA • Automática

18. Reação de sequenciamento e leitura automatizada anelamento dos primers denaturação

20. 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGATCT Organizando as Seqüências de DNA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

21. Exemplo de gel utilizado nos seqüenciadores de gel (ex.: 377). A diferença de tamanho permite a separação dos grupos de fragmentos, e esta “distribuição normal” da passagem dos fragmentos é representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqüência (read).

22. Generic Sequencing Instrument Electrical Field - Laser + GCTATAGTTGATTCCT

23. DYEnamic ET Terminators – Pré Mix • Energy Transfer Dyes • Fluorescein Donor Dye • Standard Rhodamine Acceptor Dyes • Fluorescein-R110-ddGTP • Fluorescein-R6G-ddTTP • Fluorescein-TAMRA-ddATP • Fluorescein-ROX-ddCTP

25. + N N O - CO 2 ddNTP + Ar Laser Radiationless + N N O OH O O - CO EnergyTransfer - 2 CO 2 ddNTP Transferência de energia aumenta a fluorescência

26. Fluorescein-TAMRA-ddATP Fluorescein-R110-ddGTP Fluorescein-R6G-ddTTP Fluorescein-ROX-ddCTP 100% 90% 80% 70% 60% Normalized Fluorescence Emission (Excitation at 488 nm) 50% 40% 30% 20% 10% 0% 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) DYEnamic ET terminator - espectro de emissão

30. Leitura da seqüência de DNA

31. Análise dos resultadospor Bioinformática

32. Montagem Limpeza das seqüências: 􀂄remoção de seqüências ribossômicas 􀂄remoção de seqüências de vetor 􀂄remoção da região de poliA 􀂄corte por qualidade 􀂄eliminação das derrapagens

33. reads clonar em vetor sequenciamento Shotgun do genoma inteiro DNA genômico Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun)

34. Reconstrução do DNA original a partir do fragmentos (clusterização) reads Sequência consenso (DNA original) A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos

35. Shotgun de pedaços do genoma Clonar em BAC’s e sequenciar apenas as pontas de cada fragmento Quebrar em pedaços de 2000pb clonar em vetor e sequenciar os fragmentos Quebrar em pedaços aleatoriamente desde 50Kpb até 300Kpb DNA genômico ~800 bp ~800 bp

36. O programa PHRED lê o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequência : 0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ... Genome Research 8 (3) (1998), 175-185

37. background • A identificação dos picos é feita através de uma transformada de fourier do sinal • A nota é ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a altura do background

38. Analisando o cromatograma Região de qualidade alta • Picos bem definidos e grandes. • Linha de base boa. • Distância entre picos anterior e posterior constante.

39. Região de qualidade média – poucas ambigüidades • Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio. • Linha de base boa a razoável. • Distância entre picos anterior e posterior razoável.

40. Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade • Picos mal definidos e de tamanho pequeno. • Linha de base confusa. • Distância entre picos anterior e posterior inconstante.

41. - Sequenciamento produz seqüências da ordem de 500 pb Onde q é a nota phred e P é a probabilidade encontrar uma base errada : - Nota phred = 20 => 1 base errada a cada 100 (99%) - Nota phred = 30 => 1 base errada a cada 1000 (99.9%)

42. Pirosequenciamento Science 281 (1998), n. 5375, 363-365

43. Ligação do adaptador e separação em fita simples Shotgun do genoma inteiro DNA genômico Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun)

44. Pirosequenciamento • O adaptador permite que o DNA se ligue em grânulos minúsculos (diâmetro de 28 mm). Apenas um DNA é ligado em cada grânulo • Os grânulos são envolvidos em gotas de óleo que contêm todos os reagentes necessários para amplificar o DNA • Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para evitar contaminação e consegue produzir 10 milhões de cópias numa reação de pirosequenciamento • Um pmol de DNA numa reação de pirosequenciamento produz 1011 moléculas de ATP gerando mais de 109 fótons, num comprimento de onda de 560 nm, e num período de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma câmera de CCD Nature 437 (2005), 326-327

45. O sequenciador 454 Câmera de CCD Câmara de fluxo contendo as amostras e as fibras ópticas (1,6 milhões/slide) Bombeamento de fluídos Computador Nature 437 (2005), 376-380

46. Pirograma Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt

47. São obtidas seqüências de até 100-120 b

48. Sanger vs Pirosequenciamento • Depende de clonagem em bactéria (2 semanas de trabalho) • Não há clonagem • 1 milhão de pb em 24 horas • 25 milhões de bp em 4 horas (100x mais rápido) • Reads de ~700 bp • Reads de ~100 bp • 6 meses de sequenciamento, 24 horas por dia, para sequenciar o genoma de um fungo • 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo • Clones de fita dupla permitem seqüenciamento em ambas direções (facilita orientação e montagem) • Fragmentos fita simples não permitem seqüenciamento em ambas direções Conclusão : a união faz a força PNAS 103 (2006), 11240 SANGER Pirosequenciamento

49. Os organismos possuem padrões

50. As moléculas também.