基因工程的基本操作程序

1. 基因工程的基本操作程序

2. 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定

3. 阅读书本8——11页“目的基因的获取”部分内容，完成《导与练》第6页左侧的自主学习阅读书本8——11页“目的基因的获取”部分内容，完成《导与练》第6页左侧的自主学习 • 阅读选修一60页PCR的过程

4. 一、目的基因的获取 编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________ 请举出三个以上的例子 2、获取目的基因的常用方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成

5. (1)从基因文库中获取目的基因 什么是基因文库？ 什么是基因组文库？ 什么是部分基因文库？ 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 目的基因的有关信息与什么相联系？

6. 基因组文库 部分基因文库（如cDNA文库） 概念：基因文库 （gene library） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。

7. 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库:如：cDNA文库 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.

8. 基因组文库与部分基因文库的关系

10. （一）基因文库的构建 （1）基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 许 多 DNA片段 该生物基 因组文库 与载体连接 导入受体菌群 用适当 限制酶切割 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） （2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成 核酸酶H DNA聚合酶 该生物 cDNA文库 逆转录酶 与载体连接 导入受体菌群 双链DNA (cDNA) mRNA 杂交双链 单链DNA

11. 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 cDNA文库 基因组DNA文库

12. （3）如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。

13. （2）利用PCR技术扩增目的基因 PCR——聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。

14. PCR技术 • 原理： • 前提： • 原料 • 方式 DNA复制 一段已知目的基因的核苷酸序列 模板DNA；一对引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）； ：以_____方式扩增， 即____（n为扩增循环的次数） 指数 PCR扩增仪 2n

15. 延伸 变性 复性 变性、复性、延伸三步曲（选修一P60） • 过程 • 变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA • 复性：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 • 延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链

16. （3） 人工合成 ——根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因

17. 1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法    B、基因组文库法 C、cDNA文库法   D、聚合酶链反应 A 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ D

18. 编码蛋白质 3、目的基因主要是指_______________的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_________序列，基因在________上的位置，基因的________产物mRNA，基因的_______产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在________完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的________序列，以便于合成_________。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过____________方法。 核苷酸 染色体 转录 表达 生物体外 核苷酸 引物 人工合成

19. 阅读书本11——15页，完成《导与练》第6页右侧的自主学习阅读书本11——15页，完成《导与练》第6页右侧的自主学习

20. 二、基因表达载体的构建——核心 1.过程: （1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。 （2）用___________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 相同 的黏性末端 切口 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） DNA连接酶

21. 1.过程: 一个切口 两个黏性末端 表达载体 质粒 同一种 DNA连接酶 限制酶处理 目的基因 两个切口 获得目的基因

22. 2、基因表达载体的功能 a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。

23. 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。

24. 3.基因表达载体的组成： a、目的基因 b、启动子 位于基因的首端,是mRNA结合位点 位于基因的末端,终止转录 c、终止子 检测目的基因是否导入受体细胞 d、标记基因 它们有什么作用？

25. ABCD 1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因 A 2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别 C 3、目前转基因工程可以 A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离 B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离 C. 完全突破地理隔离和生殖隔离 D. 部分突破地理隔离和生殖隔离

26. 三、将目的基因导入受体细胞 • 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。

27. 表达 插入 转入 导入 1、将目的基因导入植物细胞 能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力 特点: Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 （1）农杆菌转化法 转化过程: 表达载体 植物细胞 农杆菌 新性状 Ti质粒 目的基因 植物细胞染色DNA 构建

28. （2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。

29. （3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

30. 2、将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 方法: 操作程序: 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物

31. 3、将目的基因导入微生物细胞 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： 感受态细胞吸收DNA 表达载体与感受态细胞混合 Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞

32. 1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A．结构简单、操作方便 B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少、简单 D．性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 ①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④ B D 3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达 C

33. 4. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 ①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ C C 5. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是 ①农杆菌转化法 ②基因枪法 ③花粉管道法 ④显微注射法 ⑤胚胎移植 ⑥DNA分子杂交法 A．①②③④⑤⑥ B．①②③④⑤ C．①②③④ D．①③④⑤⑥

34. (四)目的基因的检测与鉴定 ①导入检测：目的基因是否导入受体细胞 方法—— DNA分子杂交 分子检测 检测 转录检测——分子杂交 ②表达检测 翻译检测——抗原—抗体杂交 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 个体生物学水平的鉴定 鉴定

35. 1、用β-珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是 A．镰刀型细胞贫血症 B．白血病 C．坏血病 D．苯丙酮尿症 A 2、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A．用于检测疾病的医疗器械 B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子 C．合成β-珠蛋白的DNA D．合成苯丙羟化酶的DNA片段 B

36. 思考与探究： 2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。 3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

37. 4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？ （1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。

38. 复习题 1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?(试举例说明) 2）简述农杆菌转化法

39. A 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶 D 4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

40. 5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因与运载体结合 C 6）（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（ ） A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接 B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增 C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状 D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌” ABCD B 7）下列哪项不属于基因工程技术的步骤 （ ） A．基因转移 B．基因扩增 C．基因检测 D．基因表达

41. A ATTC G G CTTAA 目的基因 作业14题（3）答案： 甲：…GTATCCATG …CATAGGTACTTAA A A T T C GGCATAC… GCCGTATG… 乙：…TCCTAG …AGCATCTTAA AATTCCATAC… GGTATG…

42. …GTATCCATGAATTC …CATAGGTACTTAAG GAATTCGGCATAC… CTTAAGCCGTATG… 目的基因 作业14题（4）答案：

43. 供体生物细胞 取出DNA 用限制酶剪去多余部分 限制酶 目的基因 基因操作的基本步骤 一、目的基因的获取—— 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。 　 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。

44. (一)从基因文库中获取目的基因 2.基因文库的构建方法 ①鸟枪法： (直接分离法) 供体细胞中的DNA 限制酶 许多DNA片段 目的基因 与载体连接 载入 运载体 分离 导入 产生特定性状 受体细胞 外源DNA扩增

45. 目的基因的mRNA 2.基因文库的构建方法 反转录酶 ②反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 杂交双链 (单链RNA/单链DNA) 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA (目的基因)

46. 2.基因文库的构建方法 ③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 蛋白质的氨基酸序列 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因

47. 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 操作简便广泛使用 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 专一性最强 思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?

48. 1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA   B、线粒体DNA C、总mRNA   D、tRNA A 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是 A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库 C

49. 1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 ①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温 A．①③④⑦⑨ B．①④⑥⑦⑧ C．②⑤⑥⑦⑨ D．①③⑥⑦⑧ D 2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个 B

50. 原核细胞的基因结构(补充内容） 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 与RNA聚合酶结合位点 原核细胞的 基因结构 ：编码蛋白质 ,连续不间断 编码区 ①不编码蛋白质。 非编码区 ②调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子 启动子