人肠道病毒简介和分类

1. 人肠道病毒简介和分类 人肠道病毒

2. 人肠道病毒发现的历史 • 脊髓灰质炎病毒：通过将标本接种至猴子体内，1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。 • 柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。 • 埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。 • 新肠道病毒：后来，新发现的病毒被按照序号命名（69~71），最近，已经命名至111型

3. 人肠道病毒型别分类 4

4. ① CoxA23与ECHO9为同一病毒，已归入ECHO9 ②CoxA15与CoxA11为同一病毒，统一命名为CoxA11 ③CoxA18与CoxA13为同一病毒，统一命名为CoxA13 ④ ECHO8与ECHO1为同一病毒，统一命名为ECHO1 ⑤ ECHO10已归入呼肠孤病毒1型（Reo 1） ⑥ ECHO22和ECHO23被划分为新的病毒属——副肠孤病毒属，分别重新命名为副肠孤病毒1型和2型 ⑦ ECHO28归入鼻病毒1A型 ⑧ ECHO34并入CoxA24，为CoxA24的变种 ⑨ 鼻病毒87型重新划为肠道病毒68型 ⑩ 肠道病毒72型划为肝病毒属中的人甲型肝炎病毒 ⑾ 猪水疱病病毒(SVDV)类似于Cox B5型

5. 人肠道病毒的毒粒结构 • ~30nm • 二十面体对称 • 无包膜 Courtesy of Linda M. Stannard, University of Cape Town, S.A.h

6. 人肠道病毒的流行病学

7. 人肠道病毒传播方式 > 粪-口途径传播: 唾液与粪便 > 呼吸道传播: 空气飞沫 > 接触传播:

8. 人 人

9. 水 洗 排毒 直接、间接接触 盘子 休闲、娱乐 门把手 河流 灌溉 海产品 污水处理厂 海洋 环境因素影响经水传播的病原体 针对 脊灰病毒、NPEV、 轮状病毒、诺如病毒，甲肝

10. 造成人肠道病毒感染与流行的因素 • 宿主因素：营养、卫生、抵抗力 • 病毒的种类 • 侵入易感个体的人肠道病毒量 • 病毒的毒性强弱 • 整个族群里含有抗体的个体（群体免疫） • 少数研究：特定HLA基因较易出现肢体麻痹症候群 • 有些研究：新生儿与婴儿易遭受严重的柯萨奇B型 、 ECHO和EV71病毒感染

11. 致病特点 ①隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。 ②病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。 ③不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。 ④感染过程中形成病毒血症。

12. 进入途径 口腔/呼吸道 咽喉及下肠胃道 传播 飞沫、接触、饮食 扁桃体、深层淋巴结、肠道淋巴结 先天性感染 微病毒血症 肝脏、 胰脏、 肾上腺 心脏 神经系统 呼吸系统 皮肤及黏膜 肌肉 病毒血症 神经系统 抗体产生、病毒血症消失，病毒感染症状改善 人肠道病毒感染的一般致病机制

13. 与人肠道病毒感染相关的疾病

14. 临床特征 • 病毒由口进入胃肠道，潜伏期为3－35天，一般7－14天。 • 90％的感染为隐性感染 • 约5％出现流产感染 • 1％～2％为非麻痹性脊髓灰质炎或无菌性脑膜炎 • 仅约0.1%出现永久性弛缓性肢体麻痹 • 极少数发展为延髓麻痹

15. 症状 脊灰 Cox A Cox B Echo 麻痹性疾病 + + + + 脑膜炎-脑炎 + + + + 心肌炎 + + + + 新生儿疾病 - - + + 胸膜痛 - - + - 咽峡炎 - + - - 发热性疾病 - + + + 出血性结膜炎 . - + - - 呼吸系统感染 + + + + 不明原因发热 + + + + 糖尿病/胰腺炎 - - + - 与人肠道病毒感染相关的疾病

16. 引起的疾病 • 麻痹性疾病 – 脊灰病毒是最常见的引起麻痹性疾病的病原体，但 其它病毒有时也可引起，如肠道病毒71型（EV71） • 无菌性脑膜炎 – 所有人肠道病毒都可以引起, 尤其常见于 5岁以下儿童； • 脑炎 –典型或者不典型的脑炎可能伴有脑膜炎症状．大 部 分病例恢复后不留后遗症； • “不明原因”发热 –由A组柯萨奇病毒（Cox A16）和EV71引起，但 B组柯萨奇病毒和某些埃可病毒也经常造成暴发； • 咽峡炎– 由A组柯萨奇病毒引起； • 传染性胸膜痛(博恩霍尔姆氏病 ，Bornholm disease) • – 通常由B组柯萨奇病毒引起；

17. 人肠道病毒病例死亡时间 早期死亡 晚期死亡 死 亡 机 率 呼吸衰竭 神经系统损伤 心衰竭 脑死亡及 中枢衰竭 1 2 3 4 5 6 14 >28 天

18. 0 8 16 24 粪便 咽拭 CSF 病毒分离 粪便 双 份 血 血清 抗体 传染性 粪-口 2 - 7 (10) 天 临床特征 0 8 16 24 感染 天 人肠道病毒感染后的病程

19. 1 2 无皮疹的手足口病重症病例 3 4 5 手足口病 手足口病皮疹分布 1. 颊粘膜和手指; 2. 手掌 ；3. 足底 ； 4. 唇粘膜； 5.咽峡炎

20. 手足口病Hand-foot-mouth Disease, HFMD • HFMD引起关注的原因 • HFMD的定义和相关病毒病原 • HFMD的标本的采集 • 中国HFMD实验室网络的初步建立和运转 • 中国大陆HFMD流行、现状和趋势 • 中国大陆2008年-2009年HFMD 的病原谱 • 分子流行病和血清流行病 • HFMD病理特征 • HFMD预防和治疗

21. 阜阳手足口病“阜阳13例不明原因肺炎死亡病例”阜阳手足口病“阜阳13例不明原因肺炎死亡病例” “疫情概况” • 病例高度散发 • 不具有传染性，可能为感染性疾病 • 只在一例中发现疹子 • 以“重症肺炎”为主要临床表现 • 病情进展迅速， 大部分入院几小时-2天 死亡 • 病因不明

22. 图3. 2008 年3月1日至5月9日阜阳市HFMD病例数

23. HFMD引起关注的原因 • 1.阜阳聚集死亡病例和较多重症病例的出现 • 2.发病到死亡进展迅速，引起社会恐慌 • 3.临床上无特效药物,重症的早期预警存在一定难度 • 4.对疫情的扩散无有效的控制手段,无疫苗 • 5.第38种法定传染病

24. 阜阳不明原因肺炎死亡病原学鉴定 4月18，中国CDC组织专家组 分析判定病原和实验室检测方向为=HEV71 流行病学 临床资料 实验室检测 证实4月23日 EV71是此次疾病的主要致病原

25. 从3月 23至4月29阜阳市死亡病例 (共22例) 确认 EV71为致病原 早期死亡病例 15

26. 15例死亡病例的临床症状 27

27. 阜阳重症和轻症病人的咽拭子EV71核酸阳性率

28. 阜阳2008年3月1至5月9日不同年龄组的HFMD病例 • 90%以上病例为5岁以下儿童 • EV71为阜阳2008年HFMD爆发的绝对优势血清型

29. 二. HFMD的定义和相关病毒病原

30. HFMD的定义 HFMD是由多种肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病 大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要临床症状。 少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。 手足口病预防控制指南（2009版）

31. 人肠道病毒（HEV71）的毒粒结构 • ~30nm • 二十面体对称 • 无包膜 Courtesy of Linda M. Stannard, University of Cape Town, S.A.h

32. 病原: HFMD可由20多种肠道病毒所引起，其中包括柯萨奇病毒、埃可 病毒和肠道病毒新的血清型。CoxA组的16、4、5、7、9、10等型, CoxB组的2、5等型,以CoxA16 和EV71最为常见。 传播途径: 粪-口途径传播: 唾液与粪便; 呼吸道传播: 空气飞沫; 接触传播 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。 HFMD为全球性传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿, 在全球广泛分 布，无明显的地域分布, 但近年EV71在东南亚几个国家或地区流行, 引起较多的重症和死亡病例。 HFMD的相关病毒病原

33. CoxA16 • 1957年在加拿大首次报告，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原； • 1959年提出HFMD命名，HFMD在全球广泛流行，无明显的地域分布。 • 发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡 • 传染性极高 • 病程约1周

34. 肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71） 1972年EV71在美国被首次确认，1974年Schmidt等首次发表从美国加利福尼亚州20例具有中枢神经系统症状患者（1969~1973年）中分离到EV71。 随后，世界上众多国家都有EV71流行的报道。EV71感染可引起HFMD、疱疹性咽峡炎、无菌性脑炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹，但更多情况下是产生隐性感染。同脊灰病毒相似，EV71对脊髓前角细胞具有一定的组织嗜性，是最常见的引起急性迟缓性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）的非脊灰肠道病毒（non-polio enterovirus，NPEV）。 EV71潜伏期一般为3－7天,感染EV71后，患者发病1~2周内可自咽部排出病毒，从粪便中排毒可持续至发病后3~5周。 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。

35. 36 三. 标本采集 粪便标本 咽拭子标本 肛拭子标本 脑脊液标本 血清标本 疱疹液标本 尸检标本

36. 标本采集注意事项 • 用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液 • 如果患者出现神经系统症状，应该采集脑脊液标本。 • 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离 病毒具有很高的诊断意义。 • 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如 病毒保存液。 • 为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发 病后尽早采集，尽快检测。 • 不能立即检测的标本应冷冻保存。 • 对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集， 恢复期血清在发病2-4周后采集。

37. 细胞系 • RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞 • HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞 • Vero细胞，来源于非洲绿猴肾细胞 • 可联合使用RD和HEp-2，或者RD和Vero细胞系进行肠道病毒的分离。 • 联合使用RD、HEp-2和Vero细胞，有助于提高肠道病毒检出率。

38. Progression of CPE: EV71 in RD-A Cell lines EV71在RD-A细胞上产生病变的过程

39. 四. 中国HFMD实验室网络的初步建立和运转 Heilongjiang Jilin Liaoning Neimeng Xinjiang Beijing Tianjing Hebei Ningxia Gansu Qinghai Shanxi Shandong Shaanxi Henan Jiangsu Xizang Shanghai Anhui Hubei Sichuan Chongqing Zhejiang Hunan Jiangxi Guizhou 1 Fujian Yunnan 1.国家实验室 2. 31个省级实验室 3.部分地市实验室 Guangxi Taiwan 2 Guangdong 3 Hainan

40. 中国HFMD实验室网络的初步建立和运转 • HFMD实验室网络标准化技术的建立及应用 • 操作规程的制定，包括： • 标本的采集和运输 • 从临床标本直接进行EV71和CVA16V RT-PCR鉴定 • EV71和CVA16 的Real-time PCR鉴定 • EV71和CVA16 VP1全长的RT-PCR扩增 • 用RD/HEp-2细胞分离EV71和CVA16 • EV71-IgM抗体的检测 • 建立了中国HFMD相关病原毒株库和数据库 • 培训: 2008年4月初在郑州，12月在杭州，2009年7月在青岛分别举办 了HFMD实验室检测技术培训班；2009年4月7-10日在北京举办了发热出 疹症侯群检测和监测技术培训班，2010年深圳HFMD实验室网络培训班

41. 肠道病毒分离物基因分型,血清流行病学检测,诊 肠道病毒分离物基因分型,血清流行病学检测,诊 断方法建立 • 质量控制 • 对省级实验室提供技术支持 • RT-PCR, Real time PCR和 IgM检测。 • 肠道病毒分离和鉴定 • 对地级实验室的质量控制 • 对地级实验室提供技术支持 • RT-PCR, Real time PCR和 IgM检 测。负责采集标本 ， 中国肠道病毒三级实验室网络 1 国家实验室 31个省级实验室 部分地市级实验室

42. 待检标本 EV71或CA16-IgM或测双份血清中和抗体滴度 RT-PCR Real time RT-PCR 检测病毒核酸 基因定型 病毒分离 CPE阳性 无CPE 中和定型 RT-PCR 基因定型 常规实验 补充实验 非肠道病毒 肠道病毒 手足口病的实验室检测流程见下图：

43. 待检标本 测双份血清 中和抗体滴度 RT-PCR Real time RT-PCR 基因定型 病毒分离 CPE阳性 无CPE 中和定型 RT-PCR 基因定型 常规实验 补充实验 非肠道病毒 肠道病毒 关键诊断技术和监测技术 HFMD检测、监测技术和标准的建立及应用 建立多种HFMD诊断方法 • 诊断RT-PCR: 从临床标本直接进行检测 • 基因型鉴定RT-PCR：VP1全长 • 用RD/HeP2细胞分离肠道病毒标准程序（SOP） • 磁珠法自动化提取咽拭子和粪便标本中肠道病毒核酸 • 基于颜色的等温扩增技术（LAMP）检测EV71和CA16核酸 • nRT-PCR自动化工作站检测EV71、CVA16和肠道病毒核酸 • rRT-PCR单通道快速检测肠道病毒 • rRT-PCR单通道快速检测EV71病毒 • rRT-PCR单通道快速检测CA16病毒 • rRT-PCR双通道快速检测肠道病毒和EV71病毒 • rRT-PCR双通道快速检测EV71病毒和CA16病毒 • rRT-PCR三通道快速检测肠道病毒、EV71病毒和CA16病毒 • EV71和CA16血清中和抗体检测方法（微量细胞中和试验） • 环境污水中肠道病毒提取、纯化和检测技术 贝尔公司使用我们研制的核心技术研制了ELISA检测血清中EV71-IgM抗体试剂盒：第一个获得药监局文号 相关检测方法应用于HFMD爆发的诊断和鉴别诊断，满足了不同层次省、地市和县级医疗卫生机构开展HFMD实验室检测和监测的迫切需要

44. 实验室诊断方法 • 病毒分离鉴定 • 病毒核酸的检测 • 普通RT-PCR • 荧光定量RT-PCR • 血清学检测 • 急性期/恢复期血清中和抗体滴定 • ELISA法检测血清IgM和IgG

45. 手足口病的实验室检测 手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定。 很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。 通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD、HEp-2、Vero等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。

46. 质量控制 • 31个省级网络实验室骨干标准化操作技术培训 • 各网络实验室负责培训地市实验室骨干 • 标本采集的时间分布、数量和质量的定期核查 • 职能考核(血清、核酸） • 标本复核(血清、核酸） • 实验室现场督导和认证 • 临床、流行病和实验室信息管理 • 质量保证

47. 质量保证 • 省级统一核酸检测方法 统一病毒分离方法 (提供用于病毒分离的细胞系RD,HeP2等) 试剂盒（或方法学）的评价 使用组合标本或核酸评价所使用的试剂盒 仪器校对 生物安全柜：每年一次 加样器：每3－6个月一次 温度监测（培养箱） • 标准操作规程（SOP） ： 血清学 细胞培养、病毒分离 PCR，RT-PCR，Real time PCR • 记录 电子版和实验记录本 • 标本和病毒的储存 • 专家组对本实验室的认证评估

48. 病毒疾病常出现的阴性结果分析 > 血清抗体： - 血清标本采集时间不对 - 非特异性抑制物质干扰 - 抗体反应微弱：抗原变异 - 病毒或病毒株选择错误 - 检测方法错误 - 实验室质量控制： - 其他 > rRT-PCR和病毒培养： - 标本采集时间过早或太迟 - 标本采集部位错误 - 标本采集技术不过关 - 标本保存不好 - 病毒培养细胞株选择错误 - 实验室质量控制 - 其他

49. 发热伴出疹症候群 肠道病毒（HEV71，CA16） 登革热病毒 伤寒、副伤寒 发热伴出疹，发热≥37.5℃， 持续一天以上， 伴有全身或局部的皮肤或粘膜出疹。 麻疹、风疹、 B19 链球菌 伯氏疏螺旋体（莱姆病） 其它 水痘

50. 10 IgG 8 6 4 IgM virus excretion IgM sensitivity ~70% 2 0 -21 -14 -7 0 7 14 21 28 35 42 Days after rash onset Rash Infection onset 麻疹病毒感染体液免疫过程 必要日期: 最后接种日期 出疹日期 出生日期 Relative levels of antibody • 用于IgM抗体检测的血清标本要在初次接触病人时马上采集，以及出疹后28天内采集 • 用于病毒分离的标本,需出疹５天内采集咽拭子或尿液