Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке.

1. Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке. Геномика и транскрипционный анализ. Проблема ИНФО. Современные возможности определения структуры и функции нуклеиновых кислот. Геномные манипуляции и технологии искусственного синтеза геномов. Матричный и безматричный синтез ДНК. Методы геномной трансплантации.

2. I II III Секвенирование Выделение геномной ДНК и создание библиотеки фрагментов. Аннотация и анализ Сборка

3. Достижения Фрагмент ДНК Многократная случайная фрагментация (Shotgun)

4. Создание библиотеки www.themegallery.com

5. Создание библиотеки Фрагмент ДНК Многократная случайная фрагментация (Shotgun) ~500 нп ~500 нп

6. Start at primer (restriction site) Grow DNA chain Include ddNTPs Stops reaction at all possible points Separate products by length, using gel electrophoresis Sanger Method: Generating Read

7. Automatic DNA sequencing

8. Electrophoresis Diagrams

9. Использованные программы Phred (http://www.phrap.org) - обработка хроматограмм LUCY (http://www.tigr.org/software/) – удаление концов вектора, оценка качества прочтений TIGR (http://www.tigr.org/software/) - сборка BAMBUS (http://www.tigr.org/software/) - взаимная ориентация контигов (построение скаффолдов)

10. Информационные проблемы • 1 запуск до 100 гбп нуклеотидов – 10 терра байт данных – стоимость хранения до 10 тыс руб. – скорость передачи от 10-20 часов • При увеличении скорости оборудования на порядок – мы приближаемся к предельной скорости передачи данных и критической стоимости обработки информации • Обработка данных 1 запуска сиквенатора – зачастую требует до 10-20 запусков алгоритмов расчета. • Стоимость вычислительных мощностей приближается к стоимости оборудования (но реактивы отсутствуют для компьютеров)

11. Молекулярные колонии

19. Polonator G.007 Solexa 1G SOLiD system Системы второго поколения Genome sequencer 20/FLX www.themegallery.com

20. Системы третьего поколениябез амплификационные (Single-molecular sequencing • Методы второго поколения, использующие ПЦР, могут выдавать ошибки, вызванные амплификацией. • SMS (Single-molecular sequencing) – новое поколение методов.

21. 454 пиросеквенирование • Амплификация в водно-масляной эмульсии • Детекция во время синтеза – флуоресценция при отщеплении пирофосфата

22. 454 пиросеквенирование – подготовка библиотеки Фрагментация геномной ДНК Получение тупых концов Пришивка адаптеров Получение одноцепочечной ДНК

23. 454 пиросеквенирование – амплификация Библиотека фрагментов ДНК Иммобилизация на бусинах Приготовление водно-масляной эмульсии Получение одноцепочечной ДНК ПЦР в эмульсии

24. 454 пиросеквенирование – считывание

25. 454 пиросеквенирование – считывание

26. SOLiD & Polonator • Амплификация в водно-масляной эмульсии • Детекция путём лигирования

27. SOLiD – подготовка библиотеки

28. SOLiD – амплификация

29. SOLiD – считывание

30. SOLiD – считывание Зонды Матрица Второй нуклеотид Первый нуклеотид

31. SOLiD – считывание 1. Праймирование и лигирование Лигаза Сиквенсовый праймер Адаптер Матрица Эмиссия Возбуждение 2. Детекция 3. Кэпирование

32. SOLiD – считывание 4. Отщепление флуоресцентной метки 5. Повторение цикла циклов 6. Денатурация и отжиг нового праймера

33. SOLiD – считывание 7. Повторение стадий 1-5 с новым праймером 8. Повторение цикла с последовательными праймерами Позиция Праймер Праймер Праймер Праймер Вставка Праймерный цикл Праймер Вставка Праймер Вставка Цикл лигирования Тестируемые позиции

34. Illumina SOLEXA • Амплификация на твёрдой подложке • Детекция во время синтеза – обратимые терминаторы с флуоресцентной меткой • Четыре вида флуоресцентных меток • Все нуклеотиды присутствуют одновременно

35. Illumina SOLEXA – подготовка библиотеки Фрагменты ДНК Адаптеры

36. Illumina SOLEXA – амплификация Адаптер Фрагмент ДНК Праймеры Адаптер Пришитые концы Свободные концы Молекулярные колонии Пришитые концы Считывание

37. Illumina SOLEXA – считывание Первый цикл считывания Следующий цикл считывания

38. Illumina SOLEXA

39. HeliScope • Нет стадии амплификации – секвенирование индивидуальных молекул • Детекция во время синтеза – обратимые терминаторы с флуоресцентной меткой • Один вид флуоресцентной метки • Последовательная промывка образца нуклеотидами

40. HeliScope Поли-А адаптер Секвенируемый фрагмент Поли-Т адаптер Подложка Детекция включения нуклеотидов

41. HeliScope Детекция флуоресценции Промывка dNTP A G C T Подложка

45. Новые методы секвенирования

46. Методы нанопорового секвенирования

47. Методы нанопорового секвенирования

48. Методы нанопорового секвенирования

49. Методы нанопорового секвенирования

50. Методы нанопорового секвенирования