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第十四章 核酸的物理化学性质

第十四章 核酸的物理化学性质. 一、核酸的水解. 二、核酸的酸碱性质. 三、核酸的紫外吸收. 四、核酸的变性、复性及杂交. 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国. 一、核酸的水解. （一）酸水解. 对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键 嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键. 脱嘌呤： pH1.6 ， 37℃ ，对水透析 pH2.8 ， 100℃ ， 1h 脱嘧啶： 98-100% 甲酸， 175℃ ， 2h 三氟乙酸， 155℃ ， 60min （ DNA ）或 80min （ RNA ）. 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成.

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第十四章 核酸的物理化学性质

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  1. 第十四章 核酸的物理化学性质 一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收 四、核酸的变性、复性及杂交 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  2. 一、核酸的水解 （一）酸水解 对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键 嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键 脱嘌呤： pH1.6，37℃，对水透析 pH2.8，100℃，1h 脱嘧啶： 98-100%甲酸，175℃，2h 三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或 80min（RNA） 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成

  3. （二）碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.3～1mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。 DNA抗碱水解 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  4. （三）酶水解 非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5′-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3′-核苷酸 特异的磷酸二酯酶： 核酸酶 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  5. 1、核酸酶的分类 ★底物专一性： 核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase ★作用方式： 核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶 (endonuclease) 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶 ★磷酸二酯键的断裂方式： 5′-（寡）核苷酸 3′-（寡）核苷酸 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  6. 2、RNAase ★RNase H 作用于DNA-RNA中的RNA链 ★牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2 产物：3′-嘧啶核苷酸或以其为结尾的寡核苷酸。高度专一的内切酶 ★RNase T1 耐热、耐酸 产物：3′-鸟苷酸或以其为结尾的寡核苷酸，专一性更高 ★RNase T2 产物：将tRNA完全水解为以3′-腺苷酸结尾的寡核苷酸 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  7. 3、DNase ★核酸酶S1 作用于单链DNA部分 ★牛胰脱氧核糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA，产物：以5′-磷酸为末端的寡核苷酸 ★牛脾脱氧核糖核酸酶，DNase Ⅱ 产物：以3′-磷酸为末端的寡核苷酸 ★DNA限制性内切酶 4、N-糖苷酶 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  8. 二、 核酸的酸碱性质 磷酸和碱基均能发生两性解离。 DNA等电点 4～4.5 RNA等电点 2～2.5 1、碱基的解离 P504 2、核苷的解离 P505 3、核苷酸的解离 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  9. 腺嘌呤核苷酸 pK2 = 3.7 含氮环 pK3 = 6.2 第二磷酸基 pK1 = 0.9 第一磷酸基 鸟嘌呤核苷酸 pK2 = 3.7 含氮环 pK3 = 6.1 第二磷酸基 pK1 = 0.7 第一磷酸基 烯醇式羟基 pH 小牛胸腺DNA的滴定曲线 离子化程度 核苷酸的解离曲线 胞嘧啶核苷酸 pK2 = 4.3 含氮环 pK3 = 6.3 第二磷酸基 pK1 = 0.8 第一磷酸基 尿嘧啶核苷酸 pK1 = 1.0 第一磷酸基 pK3 = 6.4 第二磷酸基 烯醇式羟基 pH

  10. 三、核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290 nm的紫外波段有强烈的光吸收，　λmax=260 nm 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  11. 1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 2、含量计算 1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应） 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  12. 四、核酸的变性、复性及杂交 (一)变性 核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  13. 3 2 0.4 1 0.3 光吸收 0.2 1 2 3 天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值 0.1 220 240 260 280 波长（nm） ★变性因素： 热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） ★变性后的理化性质： 260 nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。

  14. ★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度（Tm）。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链），A260= 1.37。当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82～95℃之间。

  15. 影响DNA的Tm值的因素 ①DNA均一性 。 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。 ②G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44

  16. ③介质中离子强度 离子强度高，Tm高。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  17. (二)复性 变性DNA在适当（一般低于Tm20～25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。 ★复性机制：10～20bp成拉链 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 ★DNA片段越大，复性越慢； ★DNA浓度越大，复性越快。 ★复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。

  18. ●1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0mmol/L，则●1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0mmol/L，则 50%复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒 全部复性， Cot=10-4， t=0.1秒 ●E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则 复性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。 复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，5758天。 ●根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数

  19. (三) 分子杂交 不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）。 制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例：southern印迹法 分子杂交的原理示意图 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  20. 1、Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影 变性（NaOH 0.5mol/L） 转膜（NC膜，尼龙膜） 固定（80℃，4-6h） 杂交（高盐浓度，68℃，几小时） Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  21. 2、Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  22. 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

  23. 3、Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

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