מעבדה מס' 3

1. מעבדה מס' 3 R+L RL Kd=[R][L]/[RL] קישור [H3] – קלונידין לרצפטורים α2 אדרנרגיים מטרות: 1. קביעת Kd עבור קלונידין 2. קביעת ריכוז הרצפטורים ה-α2 אדרנרגיים בממברנה (Bmax) • הגדרות: • RL = B (bound) רצפטור וליגנד קשורים • R + RL = Bmax מקסימום אתרי קישור לליגנד • = מס' הרצפטורים ה-α2 אדרנרגיים בממברנות • L = F ליגנד חופשי (מזניחים את B לעומת F)

2. שיטות להפרדת ליגנד חופשי מהקומפלקס • 1. צנטריפוגה • חיסרון: • ליגנד חופשי יכול לשקוע, ולכן ההפרדה קשה. • 2. דיאליזה בשיווי משקל • בשיווי משקל, ריכוז הליגנד החופשי יהיה זהה בתאים A ו-B. לכן, כמות הליגנד הקשור היא: • cpm B – cpm A = cpm (bound) • חיסרון: • - זמן רב עד הגעה לשיווי משקל • - יכולה להתרחש אינאקטיבציה או פירוק של הרצפטור • שיטה זו מתאימה גם לקבועי קישור קטנים (אפיניות נמוכה, Kdגבוה) • הליגנד עלול להיקשר לממברנה של הדיאליזה • 3. פילטרציה - פילטר מסיבי זכוכית • חיסרון: • ספיחה של ליגנדים הידרופוביים לסיבי הזכוכית. לכן, חייבים לשטוף וכתוצאה הקומפלקס עלול להתפרק (ולהסיט את שיווי המשקל). • לפיכך, מתאים ל-Kd של כ-5nM(Kd נמוך = אפיניות גבוהה בין הליגנד והרצפטור)

3. שיטת הפילטרציה מותנית באפיניות הליגנד לרצפטור Kon R + L RL Koff יחידות: מאפיין ראקציה מסדר ראשון כי הוא תלוי רק בגורם אחד RL • 1 • Sec M*sec Kd = Koff = [R][L] Kon [RL] מאפיין ראקציה מסדר שני כי הוא תלוי בשני גורמים R + L חישוב זמן מחצית חיים של קומפלקס עם Kd בין 1-10nM: t1/2 = ln2 = ln2 = ln Koff Kd*Kon (10-9~10-8)M*108M-1*sec-1 t1/2 = 0.7 - 7 sec Kon מקסימלי הוא קבוע הדיפוזיה: מבטא את תנועת החלקיקים (במים לדוגמא). במצב של Kon מקסימלי כל התנגשות בין L ו R מביאה ליצירת קומפלקס RL Kon(max) = 108M-1 * sec-1 זהו ערך זמן מינימלי כיוון שחישבנו אותו על סמך קבוע הדיפוזיה (Konמקסימלי). מסקנה: השיטה מוגבלת לבחירת קומפלקס רצפטור-ליגנד מתאים (עם ערך Kd מספיק נמוך) המשמעות המעשית עבורנו: 1.פילטרציה מהירה (ע"י ואקום) 2. עבודה בקור, להקטנת Koff (הגדלת t1/2)

4. S+N cpm (B) S N [clonidine] (F) N קישור לא ספציפי S קישור ספציפי S+N קישור כולל • קישור ספציפי לרצפטורים α2 אדרנרגיים • קישור לא ספציפי לחלבונים ושומנים ממברנליים, סיבי הפילטר ודפנות המבחנה • עקום הקישור הלא ספציפי הוא לינארי כי הוא תלוי רק ב-[L] • עקום הקישור הספציפי הוא עקום רוויה כי אתרי הקישור מוגבלים • הקישור הלא ספציפי נקבע ע"י הוספת NA קר בריכוז גבוה • מדוע נעשה שימוש ב-NA קר ולא בקלונידין קר? • ישנם בממברנה אתרי קישור ספציפיים לקלונידין, שאינם α2 אדרנרגיים ואנו מעוניינים להחשיב אתרים אלו כקישור לא ספציפי • NA שונה מבנית מקלונידין, ולכן NA יכיר את הרצפטורים ה-α2 אדרנרגיים בלבד ורק אותם הוא יחסום. כך נוכל למדוד את הקישור הלא ספציפי שנובע מאתרים ספציפיים לקלונידין ושאינם רצפטורים α2 אדרנרגיים • הפילטרים הספוגים בקלונידין מסומן משמשים למדידת total = B+F

5. B רצפטורים קשורים Bmax*F B = Kd + F Vmax*[S] V = Km + [S] Bmax 50% Kd F ליגנד 1 = Kd * 1 + 1 B Bmax F Bmax (Bmax-B)*F Kd = B B = Bmax - B F Kd Kd שיטות לינאריזציה של עקומת הרוויה: כמו משוואת מיכאליס-מנטן: אפשר להפוך את משוואת העקומה למשוואה של קו לינארי, ע"י החלפת המונה במכנה ואז מקבלים את משוואת linweaver-burk אפשר גם לבודד את ה-Kd מנוסחת עקום הרוויה ולהפוך אותה למשוואה של קו לינארי, ואז מקבלים את משוואת scatchard

6. 1/B (mg/fmol) 1/Bmax a = Kd/Bmax -1/Kd 1/F (1/nM) Linweaver-burk יתרון: רוב הנקודות מתרכזות ליד ציר ה-y (ריכוזי רוויה), נקודת החיתוך ברורה ולכן Bmax אמין חיסרון: הנקודות הרחוקות מציר ה-X (ריכוזים נמוכים) מפוזרות ומשפיעות על קביעת שיפוע הקו. לפיכך, Kd לא אמין

7. B/F (fmol/mg*nM) B (fmol/mg) R+L RL Kd=[R][L]/[RL] B/F Kd = (Bmax – B)F B a = -1/Kd Bmax B = Bmax – B F Kd Kd Scatchard יתרון: הנקודות מפוזרות לאורך הגרף באופן אחיד ולכן קביעת Kdהינה אמינה חיסרון: בריכוזי רוויה, B לא משתנה אבל B/F הולך וקטן עם העלאת הריכוז. לכן, יש פיזור אנכי של נקודות בקרבת ציר ה-x וקשה להחליט היכן לחתוך את הציר. לפיכך, קביעת Bmax פחות אמינה

8. הנחות עליהן מבוססים הפיתוחים: 1. יחס קישור RL הוא 1:1 ואין קואופרטיביות 2. ריכוז הליגנד גדול בהרבה מריכוז הרצפטור (לכן L=F) 3. הרצפטור יכול להיות במצב חופשי או בקומפלקס, ללא צורות ביניים 4. כל המדידות נעשות במצב של שווי משקל

9. שיטות לזיהוי קרינה: • קרינת β= פליטת אלקטרון תוך כדי התפרקות • מונה גייגר: האלקטרונים המשתחררים נקלטים ע"י גז שעובר יינון ויוצר מתח חשמלי • חשיפה לפילם: האלקטרונים נקלטים ע"י יוני Ag+. אלו מתחזרים, שוקעים ויוצרים בנד שחור על הפילם • מונה סנטילציה: פלט מעבד: מתרגם את האותות החשמליים ל-cpm מדידה כפולה: רק התפרקות שנמדדה בו זמנית ע"י שני החיישנים תתורגם ל-cpm Photomultiplier: אנרגיית הפוטון הופכת לפוטנציאל חשמלי, תוך כדי הגברת הסיגנל דוגמא יש צורך להשתמש בנוזל סנטילציה, על מנת להגביר את הסיגנל (רק במקרים בהם קרינת ה-β נמוכה, כמו בטריטיום)

10. יותר חומר רדיואקטיבי יותר התפרקויות (dpm) יותר אלקטרונים מעוררים פוטנציאל חשמלי גדול יותר יותר ספירות (cpm) dpm = disintegrations per minute cpm = counts per minute cpm/dpm = 0.5 = יעילות המונה Ci = מספר ההתפרקויות של גרם רדיום = 2.2*1012dpm דקה Specific radioactivity = Ci = כמות חומר חם mmole סה"כ חומר אם כך:

11. איזוטופים רדיואקטיביים הנמצאים בשימוש בביולוגיה: