第四章酶化学

Enzyme 第四章酶化学

提要 酶的概念酶的分类与命名酶的化学本质酶的结构与功能的关系酶作用的专一性酶作用的机理酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素酶的制备与酶活力的测定酶的应用

2H2O2 2H2O + O2 一、酶的概念酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。酶的催化特点： 1.高效性：通常要高出非生物催化剂催化活性的106~1013倍。 1mol过氧化氢酶 5×106molH2O2 1mol离子铁 6×10-4molH2O2

2.专一性：酶对底物具有严格的选择性。 3.敏感性：对环境条件极为敏感。 4.可调性：酶活性的调节和酶合成速度的调节。

二、酶的分类与命名 1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类： 1. 氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。 AH2 + B（O2） A + BH2（H2O2，H2O）（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。 AH2 +B A +BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）

OH OH O2 + C=O OH C=O OH （2）氧化酶类 ①催化底物脱氢，氧化生成H2O2： AH2 + O2 A + H2O2（需FAD或FMN） ②催化底物脱氢，氧化生成H2O： 2AH2 + O2 2A + 2H2O （3）过氧化物酶 ROO + H2O2 RO + H2O + O2 （4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）（顺，顺-已二烯二酸）

RH + O2 + 还原型辅助因子 ROH + H2O + 氧化型辅助因子（又称羟化酶） 2. 转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。 A·X + B A +B·X 根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。 3. 水解酶类：催化加水分解作用。 AB + H2O AOH + BH

CH3 CH3 C=O C=O COOH H HCCOOH CH2COOH HOOCCH HO—CH—COOH 4. 裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。 C—C键 + CO2 C—O键 + H2O

COOH COOH CH—NH2 CH CH2 HC COOH COOH A B C—N键 + NH3 5. 异构酶：催化各种异构体之间的互变。常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。

A + B + ATP A·B + ADP +Pi 乳酸脱氢酶EC 1. 1. 1. 27 第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH 第1亚亚类，H受体为NAD+ 该酶在亚亚类中的流水编号 6. 合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。

酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸：NAD+氧化还原酶惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。

三、酶的化学本质 （一）大多数酶是蛋白质 1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。酶是蛋白质的证据。 1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。

（二）酶的辅因子 单纯酶酶结合酶（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子辅酶：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基：与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。辅因子金属激活剂：金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。

（三）单体酶、寡聚酶和多酶复合物 1.单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。 2.寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。 3.多酶复合物 (multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。

+ EⅢ EⅢ EⅢ 脲 + EⅠ EⅠ EⅡ EⅡ EⅡ 丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（EⅠ）、硫辛酰转乙酰酶（EⅡ）和二氢硫辛酰脱氢酶（EⅢ）。碱性

四、酶的结构与功能的关系 （一）活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。结合基团专一性活性部位催化基团催化性质必需基团维持酶的空间结构

M M M M M M M M M M M M4 M3H M2H2 MH3 H4 H H H H H H H H H H H （二）酶原的激活没有活性的酶的前体称为酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。（三）同工酶(isoenzyme) ——能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。乳酸脱氢酶（LDH）

五、酶作用的专一性 族（基团）专一性结构专一性绝对专一性酶作用的专一性立体异构专一性

O 酯酶：R—C—O—R′ + H2O RCOO- +R OH + H+ ′ α-葡萄糖苷酶 +H2O + ROH CH2OH CH2OH O R O O 5 5 OH OH 1 1 OH OH OH OH OH O 脲酶：H2N—C—NH2 + H2O 族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。 2NH3 + CO2

六、酶的作用机理 （一）酶的催化作用与分子活化能化学反应自由能方程式ΔG =ΔH -TΔS （ ΔG是总自由能的变化， ΔH是总热能的变化，ΔS是熵的变化）当ΔG＞0，反应不能自发进行。当ΔG＜0，反应能自发进行。活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自由能。

促使化学反应进行的途径： • 用加热或光照给反应体系提供能量。 • 使用催化剂降低反应活化能。酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。（二）中间产物学说 E + S ES E +P 中间产物存在的证据： 1.同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）； 2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。

（三）诱导嵌合学说 “锁钥学说”（Fischer，1890）：酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。诱导嵌合学说（Koshland，1958）：酶活性中心的结构有一定的灵活性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。（四）使酶具有高催化效率的因素酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为分子内的催化反应。

1. 邻近定向效应：酶与底物结合成中间产物过程中，底物分子从稀溶液中密集到活性中心区，并使活性中心的催化基团与底物的反应基团之间正确定向排列所产生的效应。 2. “张力”与“形变”：酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的某些键的键能减弱，产生键扭曲，降低了反应活化能。 3. 酸碱催化：通过想反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作为酸）夺取质子来达到加速反应的一类催化。（广义酸碱催化，Bronsted的酸碱定义）蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基。影响酸碱催化反应速度的两种因素：（1）酸或碱的强度（pK）；（2）质子传递的速度。His的咪唑基最活跃。

：： —CH2—S —CH2—O · · · · H H —CH2—C=CH ： HN N CH 4. 共价催化：底物分子的一部分与酶分子上的活性基团间通过共价结合而形成的中间物，快速完成反应。 Lewis的酸碱电子理论：酸是可以接受电子对的物质，而碱则是可以提供电子对的物质，前者是亲电物质，后者是亲核物质。共价催化又称亲核或亲电子催化。实际上也是酸碱催化。亲核物质亲电物质 Ser-OH Cys-SH His-咪唑基

5. 微环境的影响 酶的活动中心由于微环境的影响，存在高浓度的酸和高浓度的碱，可以有多种催化方式的环境有利于反应的进行。（四）酶与反应的过渡态互补酶与底物的过渡态互补，亲合力最强，释放出结合能使ES的过渡态能级降低，有利于底物分子跨越能垒，加速酶促反应速度。（五）抗体酶（abzyme） ——即是抗体又具有催化功能的蛋白质，是具有催化活性的抗体。

产物生成量 酶反应进程曲线 10 20 30 40 50 60 min 七、酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素（一）酶反应速度的测量用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度。测定反应的初速度。

Vmax v [S] （二）酶浓度对酶作用的影响在有足够底物和其他条件不变的情况下： v = k [E] （三）底物浓度对酶作用的影响 1. 底物浓度对酶反应速度的影响零级反应 v = k [E] 一级反应 v = k [S]

S + E ES E + P k2 + k3 Vmax · [S] 设 km= ——— v = —————— k1 km + [S] 用中间产物学说解释底物浓度与反应速度关系曲线的二相现象： k1 k3 k2 当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。 2. 米氏方程式（Michaelis-Menten equation）（km＞＞[S]，v = k[S]； km＜＜[S]，v = Vmax）

3. 米氏常数的意义及测定 v = Vmax/2，则： km= [S] 意义：（1） km是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。（2）从km可判断酶的专一性和天然底物。 Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。（3）当k2＞＞k3时， km的大小可以表示酶与底物的亲和性。

S + E ES E + P [S][E] km= ks = ———— [ES] ∵ km= （k2 +k3)/k1 Km ≈k2 / k1 ∴ km可以看作ES的解离常数ks：当km大，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。

[S] v 1000km 0.999V 100km 0.99V 10km 0.91V 3km 0.75V 1km 0.50V 0.33km 0.25V 0.10km 0.091V （4）从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。

Vmax · [S] v = —————— km + [S] 从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90%，则 90%V =100%V[S]/(km +[S]) 即 [S] = 9km 在进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。

（5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。（5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。乳酸脱氢酶（1.7×10-5）乳酸丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）丙酮酸乙酰CoA 丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）乙醛当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。

km 1 1 1 —— = —— · —— + —— v 1/v V [S] V 1/ [S] 米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从v与[S]的关系曲线求得V，然后再从1/2V求得相应的[S]即为km（近似值）。通常用Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）（y = ax + b）斜率= km/Vmax 1/Vmax -1/km

v （四）pH对酶作用的影响最适pH（optimum pH） 1.最适pH 表现出酶最大活力的pH值 2.pH稳定性在一定的pH范围内酶是稳定的 pH pH对酶作用的影响机制：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。

v T （五）温度对酶作用的影响最适温度两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；2.温度升高，热变性速度加快。（六）激活剂对酶作用的影响 ——凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。

S + E ES E + P （七）抑制剂对酶作用的影响 ——使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂（I）。 1. 不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。 + I ↓ EI E—SH +ICH2COOH →E—S—CH2COOH + HI

（2）可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。（2）可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。 1. 反应体系中不加I。 2 1 v 2.反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂。 3 3.反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。 [E]

v v [E] [E] 不可逆抑制剂的作用可逆抑制剂的作用 [I ]→ [I ]

S + E ES E + P v V[S] v = ——————— km(1+[I ]/ki)+[S] [S] ①竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。特点：1）抑制剂和底物竞争酶的结合部位 + I ↑↓ EI ki = [E][I]/[EI] 无 I 2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。有 I V/2 3）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。 km km ′

S + E ES E + P + I ↑↓ EI + I ↑ EIS +[S] E+P v V ———— · [S] 1+[I]/ki v = ——————— km + [S] [S] ②非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。无 I 有 I V/2 km (′)

S + E ES E + P + I ↑↓ ESI E+P V · [S] v [I] 1 + —— ki v = ——————— km + [S] [I] 1+ —— ki [S] ③反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。 km ′ km

v [S]90%V [S]90%V —— ＜ 81 —— = 81 [S]10%V [S]10%V [S]90%V —— ＞ 81 [S]10%V [S] （八）酶的变（别）构效应 ——有些酶具有类似血红蛋白那样的别构效应，称为别构酶。特点：1.一般是寡聚酶；2.具有别构效应；3.v对[S]不呈直角双曲线。

v ATCase（天冬氨酸转氨甲酰酶）的抑制剂是CTP，激活剂是ATP。 +ATP使酶饱和 +ATP +CTP V/2 S0.5 [Asp]

八、酶的制备与活力的测定 ——酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml）在最适的反应条件（25℃）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1μmol/min 在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s 1kat = 6×107IU

工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。优点：不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到，微生物繁殖快，产酶量由丰富。还可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。酶分离纯化的三个基本步骤：抽提，纯化，结晶或制剂。方法： 1.根据溶解度不同（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法）； 2.根据酶与杂蛋白分子大小的差别（凝胶过滤法、超离心法）； 3.根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同（吸附分离法）； 4.根据带电性质（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚焦层析法）； 5.根据酶与杂蛋白的稳定性差别（选择性变性法）； 6.根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用（亲和层析法）。

每次比活力 纯化倍数= —————— 第一次比活力每次总活力产率%（回收率）= —————— ×100 第一次总活力酶的纯度：比活力= 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法

酶的保存：1.低温（0~4℃，-20℃）；2.高浓度较稳定；3.加入稳定剂；4.固定化。酶的保存：1.低温（0~4℃，-20℃）；2.高浓度较稳定；3.加入稳定剂；4.固定化。酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。

九、酶的应用 • 工业上酶应用的优点： • 酶的催化效率高，专一性强，不发生副作用。 • 酶作用条件温和。 • 酶及其反应产物大多无毒性。酶工程：酶的生产、制备和应用。

ATP ADP 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖葡萄糖激酶反馈抑制：在代谢过程中局部反应产物对催化该反应的酶所起的抑制作用。抑制反馈抑制可认为是可逆抑制。别构抑制：酶的别构位与变构剂结合即会引起酶活性位的构象改变从而改变酶的活性。凡因负变构剂与酶的别构位结合而引起的酶活性下降称为别构抑制。

第四章 酶化学