به نام پروردگار

1. به نام پروردگار

2. یادآوری • گروه بندی و انتخاب موضوع تحقیق؟ • نحوه ارایه: پاورپوینت- تحقیق در چند صفحه همراه منابع • تعریف بیوتکنولوژی • مثالهایی از بیوتکنولوژی کلاسیک • بیوتکنولوژی مدرن • کلونینگ چیست؟ • تراریخت چیست؟ • انسان شبیه سازی شده؟

3. بیوتکنولوژی جلسه دوم PCR

4. واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز Polymerase chain reaction

7. 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Primase 5’ Single strand binding proteins Laging Strand 5’ 5’ 3’ 5’ RNA Primers DNA Polymerase 5’ 3’ Helicase Leading Strand 5’ 3’ همانند سازی DNA Okazaki fragment

8. آنزیم های کلیدی در همانند سازی DNA • DNA Polymerase • DNA Ligase • Primase • Helicase • Topoisomerase • Single strand binding protein

9. PCRچیست؟ • روشی که در آن قسمت خاصی از DNA الگو توسط آنزیم پلیمراز در سیکلهای گرمایی تکثیر می گردد • جایگزین روش کلونینگ ژن در باکتری: • ساده تر • کم هزینه تر • سریعتر

10. تاریخچه • 1985كری موليس • 1993 برنده نوبل

11. دلایل پیشرفت این روش • DNAپلیمراز مقاوم به حرارت • دستگاههای ترمال سایکلر

12. مواد مورد نیاز • آب دیونیزه • پلیمراز((Taq • نوکلئوتید (dNTPs) • پرایمرها • بافر آنزیم • کوفاکتور(Mg) • الگو(DNA)

13. مراحل واکنش PCR • دناتوراسیون اولیه • مراحلی که چندین سیکل تکرار می شوند • دناتوراسیون • اتصال پرایمرها • طویل شدن • طویل شدن نهایی

14. Overview of PCR • Temperature Cycling • Denaturation 94° • Annealing 55° • Extension 72° • 2. Every cycle DNA between primers is duplicated

18. PCR Amplification

19. Exponential Amplification

20. Melting 100 94 oC Temperature 50 0 T i m e 3’ 5’ 5’ 3’ PCR

21. Melting 100 94 oC Temperature 50 0 T i m e 3’ 5’ PCR Heat 5’ 3’

22. Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extension Annealing Primers Temperature 72 oC 50 oC 50 0 T i m e 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ PCR

23. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extension Annealing Primers Temperature 72 oC 50 oC 50 0 T i m e 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ PCR Heat Heat 5’

24. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extension Annealing Primers Temperature 72 oC 50 oC 50 0 T i m e 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ PCR

25. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extension Annealing Primers Temperature 72 oC 50 oC 50 3’ 5’ 0 5’ T i m e 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ PCR Heat Heat

26. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extension Annealing Primers Temperature 72 oC 50 oC 50 3’ 5’ 0 5’ T i m e 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ PCR

27. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extension Annealing Primers Temperature 72 oC 50 oC 50 3’ 5’ 0 5’ T i m e 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ Fragments of defined length 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ PCR

28. Plateau phase Linear phase End point analysis on agarose gels Exponential phase Polymerase Chain Reaction PCR Product Cycles

29. الکتروفورز

30. عوامل موثر در PCR • Reagent and instrument • User mistakes • Template • Primers

31. برخی کاربردها • تشخیص بیماری ژنتیکی • تعیین هویت افراد • تشخیص بیماری ویروسی • تیتر ویروسی توسط Real-Time PCR • تکثیر قطعه خاص ژنی برای ژن کلونینگ • ایجاد جهش برای ژن کلونینگ • اضافه کردن قطعات خاص برای ژن کلونینگ • بررسی بیان ژن RT-PCR

32. مقدمه ای بر Real Time PCR

34. What’s Wrong With Agarose Gels? • * Low sensitivity • * Non-automated • * Size-based discrimination only • * Results are not expressed as numbers • * Ethidium bromide staining is not very quantitative

35. Three general methods for the quantitative detection: 1-TaqMan, Beacons, Scorpions 2. Hybridisation probes 3. DNA-binding agents (SYBR Green) The first two methods are specific formats.

37. Fluoresces when bound to dsDNA

40. DNA Polymerase 5' exonuclease activity

41. Taqman probes are “hydrolysis” probes Polymerization TaqMan® Probe Forward Primer R Q 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Reverse Primer

42. Displacement R Forward Primer Q 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Reverse Primer

43. Hydrolysis R Q 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’

44. Polymerization Completed R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’

45. Excitation FRET P Emission Amplicon Hybridization probes

46. 95oC Denaturation

47. Excitation FRET P Fluorimeter Reading Emission Tm 55oC Primer/Probe Annealing

48. 72oC Primer Extension

49. Molecular Beacons

50. Scorpion