Spektrofluorometri

1. JURUSAN FARMASI FKIK UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN Spektrofluorometri Oleh : HendriWasito, S. Farm., Apt. (http : // www.hendriapt.wordpress.com)

2. Tinjauan Umum

3. Luminescen

5. Diagram Fotoluminisensi

7. Deaktivasi molekul tereksitasi • Merupakan suatu proses kembalinya molekul yang tereksitasi ke keadaan asas (dari S1 atau T ke S0) : • Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) • Konversididalam (Internal Conversion = IC) • Pradisosiasi • Disosiasi • Konversikeluar • Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX) • Pemadamansendiri (selfquenching = SQ) • Fluoresensi (F) • Fosforisensi (P)

8. Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) • Perpindahan energi vibrasi dari molekul yang tereksitasi • Molekul yang tereksitasi kehilangan energi eksitasi vibrasionalnya (lewat tumbukan) menjadi keadaan vibrasional S2 • Terjadisangatcepat (10-3) detik • Dapat terjadi pada tingkat energi elektronik tereksitasi atau azas

9. Konversididalam(Internal Conversion = IC) • Perpindahanenergidalam 1 molekul • Elektron pindah dari tingkat energi elektronik yang lebihtinggi ke tingkat energi elektron yang lebih rendah tanpamemancarkan sinar (S2  S1 atau T2  T1) • Dapat terjadi jika kedua tingkat energi elektronik tersebutberdekatan, sehingga terjadi tumpang tindih diantaratingkat energi vibrasi

10. Pradisosiasi • Kelanjutan IC • Perpindahan electron dari suatu tingkat energi elektroniktereksitasi (mis S2) ke tingkat energi vibrasi yang lebih tinggi dari tingkat energi elektronik tereksitasi yang lebih rendah

11. Disosiasi • Putusnyasuatuikatandalam molekul karena menyerap energi sinar tanpa didahului peristiwa konversi kedalam • Elektronikatanterlepas

12. Konversikeluar • Perpindahan energi elektronik akibat antaraksi molekul yang tereksitasi dengan molekul lain • Tidakadapemancaransinar • Energi yang dipindahkan adalah energi elektronik

13. Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX) • Pembalikan arah spin elektron yang tereksitasi daritereksitasi SINGLET (S) menjadi TRIPLET (T) • dapat mudah terjadi jika tingkat energi vibrasi dari S overlapping dengan tingkat energi vibrasi dari T • Terjadi pada molekul dengan berat molekul tinggi

14. Pemadamansendiri (selfquenching = SQ) • Intensitasfluoresensiberkurang • Terjadi akibat tabrakan-tabrakan antar molekul sendiri • Adanya pemadam akan menginduksi deeksitasi dari suatu molekul analit yang tereksitasi sehingga tidak ada sinar yang diemisikan • Contoh : Oksigen bagi senyawa poliaromatis hidrokarbon

15. Fluoresensi (F) • Pemancaransinardari S1 S0 • Waktunyaamatsingkat (10-8) detik • Jikaeksitasidihentikan,fluoresensiterhenti • Emisi foton sama nilainya dengan energi ang diserap oleh suatu molekul.

16. Fosforesensi (P) • Peroses sutu molekul melangsungkan suatu transisi (emisi) dari tingkat triplet ke tingkat dasar. • Pemancaransinardari T1 S0 • Waktunyalebih lama (10-4 detik) • Jika eksitasi dihentikan,fosforisensi masih dapatberlangsung • Biasanya didahuluioleh L.A.S.

17. Efesiensi Fluoresensi Bilangan yang menyatakan perbandingan mol yangberfluoresensi dan jumlah total mol yang tereksitasi(min = 0 dan max = 1)

18. Catatan Indeks : K = Tetapan Laju F = Fluoresensi IC = Konversi didalam EC = Konversi keluar IX = Lintasan antar system PD = Pradisosiasi D = Dissosiasi Faktor Lingkungan = KIC, KEC dan KIX Faktor Struktur Kimia = KF, KPD dan KD

19. EF dan Jenis Transisi Elektron • EF lebih mungkin terjadi pada transisi * dari pada *  n karena: • Absorptivitas molar transisi * jauh lebih besar dari absorptivitas molar transisi *  n • Umur eksitasi * lebih lama dari pada umur eksitasi n  * sehingga Kn * lebih besar dari pada K* • Kix pada   * lebih kecil dari pada KIX pada n * , karena energi yang diperlukan untuk pembalikan arah spin pada   *jauh lebih besar dari pada n *

20. EF dan Jenis Transisi Elektron • Nilai absortivitas molar merupakan kebolehjadian terjadinya transisi, makin besar  makin mudah terjadi transisi  makin mudah terjadi fluoresensi. • LAS lebih sulit pada   *, maka •   * Fluoresenensi • n* Fosforisensi

21. Hubungan Intensitas Fluoresensi (PF) dengan kadar • PF adalah proporsional dengan jumlah molekul yang tereksitasi : dimana : PF = Intensitas fluoresensi Qf = Effisiensi fluoresensi P0 = Intensitas yang dikenakan pada sample P = Intensitassetelahmengenai sample

22. MenurutHukum Lambert-Beer Jikapersamaan 3 dikembangkandalamsuatuserimaka

23. Jikabckecilmaka Qf = Effisiensi fluoresensi (nilainya tetap) Po = Intensitas awal (nilainya tetap) Σ = Absorptivitas molar (nilainya juga tetap) b = Tebal kuvet (nilainya juga tetap) Sehinggapersamaanmenjadi : Pf = (Nilaitetap QF, Po, Σ dan b) c = Kc Jadi intensitas fluoresensi yang terbaca berbanding langsung dengan kadar

24. Faktor-faktor yang berpengaruhpadafluoresensi • 1. Temperatur (Suhu) • a. EF berkurangpadasuhu yang dinaikkan • b. Kenaikansuhumenyebabkantabrakanantar mol atau • dengan mol pelarut • c. Energiakandipancarkansebagaisinar • fluoresensidiubahmenjadibentuk lain misal : EC • 2. Pelarut • a. Dalampelarut polar intensitasfluoresensibertambah, • karenadalampelarut polar • b. Jikapelarut yang digunakanmengandung atom-atom • yang berat (CBr4, C2H5I) makaintensitasfluoresensi • berkurang, sebabadainteraksigerakan spin dengan • gerakan orbital elektronikatanmempercepat LAS • makaintensitasmenjadiberkurang

25. OH 3. pH pH mempengaruhi keseimbangan bentuk molekul dan ionic λ eks = 285 λ eks = 310 λ em = 365 λ em = 410 Int = 18 Int = 10 Phenol Phenolat • 4. Oksigenterlarut • Adanya oksigen terlarut dalam larutan cuplikan • menyebabkan intensitas fluoresensi berkurang sebab : • a. Oksigenterlarutolehpengaruhcahayadapat • mengoksidasisenyawa yang diperiksa • b. Oksigenmempermudah LAS

26. 5. Kekakuanstruktur (structural rigidity) Struktur yang rigid (kaku) mempunyaiintensitas yang tinggi Bifenil Fluoren EF = 0,20 Adanya -CH2- pada fluoren menyebabkan strukturnya lebih kaku

27. HubunganStrukturMolekuldanFluoresensi • Strukturmolekul yang mempunyaiikatanrangkapmempunyaisifatfluoresensikarenastrukturnyakakudanplanar • EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikatpadasistemdapatmenaikkanintensitasfluoresensi • EWG (NO2, Br, I, CN, COOH) dapatmenurunkanbahkan menghilangkansifatfluoresensi • Penambahanikatanrangkap (aromatikpolisiklik) dapatmenaikkanfluoresensi

28. Pengaturan pH dapatmerubahintensitas fluoresensi, Contoh : • Phenol menjadiphenolatmenaikkanfluoresensi • Aminaaromatikmenjadi ammonium aromatikmenurunkanfluoresensi • Heterosiklisdengan atom N, S dan O mempunyaisifatfluoresensi • Heterosiklisdengangugus NH, jikamedianyaasamakanmenaikkanintensitasfluoresensi

29. Komponen fluorometer Sampel cell Excitation filter Transmitted Light Excitation (prymary) filter Light source Fluorecent (emitted) light Fluorecence (secondary) filter Phototube Photomultiplier tube

33. Keuntungan dari analisis fluoresensi • Kepekaan yang baik karena : • Intensitasdapatdiperbesardenganmenggunakansumbereksitasi yang tepat • Detektor yang digunakansepertitabungpergandaanfotosangatpeka • Pengukuranenergiemisilebihtepatdaripadaenergiterabsorbsi • Dapatmengukursampaikadar 10-4 – 10-9 M

34. kelompokanalisisobatsecarafluoresensi (1) • Obat yang mempunyaisifatfluoresensialamiahdalamhalinitidakdiperlukantambahanpereaksi • Contoh : Quinine • Larutanobatinimengabsorbsisinar UV danmengemisisinar Vis

35. kelompokanalisisobatsecarafluoresensi (2) • . Turunanobat yang dibentukdenganpengikatandengansenyawaberfluoresensi • Contoh : Asam amino diikatolehsyclorida [ 5 –(dimethylamino) naphtalene-1-sulfonyl-hloride] dansylasamaminoyangintensitasfluoresensinyatinggi SO23CL SO3-NH-CHR-COOH O R=CH-C + - HCL NH2 OH N(CH3)2 N(CH3)2

36. kelompokanalisisobatsecarafluoresensi (3) • Membentukmolekulberfluoresensi (a. fluorophore) S - + H3C N NH3 CH2-CH2OH.2CL - - - Fe(CN)6 OH CH2 CH3 N + N Vitamin B1 Thiochrome N S H3C N CH2-CH2OH Berfluorensi  eks = 365 nm  emeks = 440 nm N CH3 N

37. SpektraEksitasidanEmisidari kinin-SO4 1 ppm • Secarateoritisspektraeksitasiidentikdenganspektraabsorsiu.v. Spektrainidapatdigunakanuntukmenentukanspesifik yang menyebabkantimbulnyaemisifluoresensi/fosforisensidan yang menimbulkanemisiyang maksimaldisebuteksitasi • Spektraemisiadalahduplikatdarispektraeksitasi.Hanyatimbulpada yang lebihpanjang. emisidipilihsuatu yang menimbulkanintensitasmaksimal

38. Cara memperoleh • Dibuatcuplikandalampelarut air, etanol, maupunsikloheksan • Lar.cuplikanmasukkankedalamkuvetspektrofotometer • Aturmonokromatoreksitasipadasuatudidaerahu.v. (misal A). Kemudianmonokromatoremisidiputarsampaidiperolehintensitas yang maksimalmisal B nm (B : emisi) • Aturmonokromator, emisipada B nm dansekarangmonokromatoreksitasi yang diubahsampaidiperolehintensitas yang maksimummisal A’ nm (A’ nm = eksitasi) • Monokromatoreksitasidiaturpada A’ nm danbuatspektraemisidenganmerecordintensitassebagaifungsidaripanjanggelombang () akandiperolehharga yang mempunyaiintensitasmaksimalmisal : B’ nm • Maka  eksitasi : A’ nm •  emisi : B’ nm

39. Beberapaobat yang bersifatfosforisensi EW : Ethanol – water = 1 : 1 EPA : campuranDiethyleter-isopentane-ethanol (5:5:2)

40. Latihan Soal • Jelaskan penggunaan fluoresensi dan fosforesensi dalam analisis kualitatif dan kuantitatif obat atau metabolitnya ? • Suatu senyawa griseofulvin standar disiapkan pada pH 7, intensitas fluoresensinya diukur pada λ eksitasi dan emisi masing-masing pada 295 nm dan 450 nm serta memberikan data sebagai berikut : Hitunglah konsentrasi obat (dalam ng/mL) dalam sampel yang memiliki intensitas fluoresensi sebesar 64 !

41. HATUR NUHUN PISAN ...... Jangan lupa untuk membaca literatur lainnya baik dari buku maupun internet serta banyak latihan soal ... Kita BISA karena BIASA ...