生物化学检验中酶的测定

1. 生物化学检验中酶的测定 广州医学院医学检验系 临床生化教研室

2. 前言 • 酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类。绝对定量法是通过特异试剂与酶作用直接测定酶蛋白量或酶分子浓度的方法。相对定量法是根据酶的催化活性或酶促反应速度来间接测定酶浓度的方法。目前临床上所用的方法多属相对定量法。

3. 本节内容 • 一、酶活性浓度的测定 • 二、酶质量浓度的测定 • 三、同工酶及其亚型测定 • 四、酶活性浓度测定的主要影响因素及控制

4. 酶活性浓度的测定

5. 主要内容 • 酶活性浓度测定的基本原理 • 酶活性浓度的测定方法 • 底物或产物浓度的检测 • 酶偶联反应法 • 工具酶与共通反应途径 • 酶活性浓度的单位

6. 酶活性浓度测定的基本原理

7. 酶催化活性的途径 • 酶催化活性可通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得。 • 用这种方法获得的酶浓度的确切名称是“酶的催化活性浓度”或简称为“酶活性浓度”。

8. 酶活性与反应速率的关系 • 若[S]>>Km，且[S]很大，米-曼氏方程式可简化为： • 此时，酶促反应的最大速度只与酶催化活性或酶量[E]成正比例， • 它是建立准确、可靠测定方法的基础。

9. 酶促反应过程的分期 • 一个典型的酶促反应过程一般包括三个阶段。 • 延滞期（lag phase）、 • 线性期（linear phase） • 非线性期（non linear phase）

10. 酶促反应时间进程曲线

11. 注意事项 • 要准确测定酶活性，必须了解不同酶反应速率和时间的关系， • 找出酶促反应速率恒定的时间， • 避开延滞期、非线性反应期。 • 传统的手工分析法无法在零级反应期测定，故结果不够准确。

12. 酶活性浓度的测定方法

13. 酶活性浓度的测定方法 • 以反应时间为依据，酶活性浓度测定方法可分为两大类 • 定时法（fixed time assay） • 连续监测法（continuous monitoring assay）

14. 定时法 • 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。

15. 定时法中酶促反应的过程

16. 注意事项 • 用定时法测定酶活性浓度， • 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， • 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定， • 避开延滞期和一级反应。

17. 连续监测法 • 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。

18. 连续监测法的测定时间

19. 注意事项 • 自动生化分析仪能自动获取规定时间内的信号，自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于自动化仪器。 • 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。

20. 底物或产物浓度的检测

21. 底物或产物浓度的检测 • 在酶活性测定方法中，无论是定时法还是连续监测法，酶促反应速度都要通过测定底物或产物来实现。 • 依据酶促反应中底物或产物的理化特性质及检测方法，酶活性浓度测定的方法可分为直接法和间接法。

22. 直接法 • 这类方法是在不终止酶促反应条件下，通过特殊的仪器直接测定反应体系中底物或产物的理化特性变化量， • 如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度的方法。

23. 基于NADH或NADPH理化特性的测定方法 • 利用NAD(P)H在340nm处的吸光度值的变化，测定各种脱氢酶的活性，该法是目前应用最广的一类方法。

24. 基于人工合成色素原底物理化特性的测定方法 • 一些水解酶类或转移酶类可通过酶促反应将化合物中的某一基团水解或移去，使无颜色的底物转变为有颜色的产物。人们把这类底物称为“色素原”底物。根据这一原理，人们设计合成了一系列底物用来测定酶活性。

26. 间接法 • 间接法是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物，然后进行测定的方法。

27. 化学法 • 大多数是在酶促反应终止后加入另一个试剂与底物或产物反应，转化为有色化合物，再用分光光度法检测。 • 部分酶类是在原来反应体系中加入一些与酶促反应无关的试剂，这些试剂只和酶促反应的某一反应物迅速作用，产生可被仪器检出的有特征性物质，但同时又不和酶作用也不影响酶活性。

28. 酶偶联法 • 是目前在酶活性测定中应用最多，最为广泛的方法。即在原反应体系中加入另一些酶试剂，将所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。 • 在临床常规酶学分析中，以NAD（P）H为辅酶或辅基的脱氢酶，以及过氧化物酶（POD）是常用的酶偶联法的酶试剂。

29. 酶偶联反应法

30. 酶偶联反应式

31. 酶偶联反应法的基本原理 • 在酶活性测定时，如果底物或产物不能直接测定或难于准确测定，可采用酶偶联法测定，即在反应体系中加入一个或几个工具酶，将待测酶生成的某一产物转化为新的可直接测定的产物，当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反应速度来代表待测酶的活性。

33. 酶偶联反应法的反应进程 • 用酶偶联法测定酶活性浓度时，酶促反应进程存在四个时相： • ①预孵育期或预温期。 • ②延滞期。 • ③稳态期或恒态期。 • ④非恒态期。

34. 酶偶联法的吸光度变化示意图

35. 注意事项 • 应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。 • 只有此阶段的吸光度才会有明显线性变化。

36. 工具酶与共通反应途径

37. 工具酶 • 在酶学分析中，作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。 • 常用的工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类，但以氧化还原酶类更多见，因为其产物最易被直接监测而成为指示酶。

39. 共通反应途径 • 在临床生物化学检验中，许多项目的测定往往使用有工具酶的参与的类似的反应原理，即所谓共通（或通用）反应途径。

40. 两类常用的通用反应途径 • NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应 • 偶联H2O2的工具酶及其指示反应

41. 酶活性浓度的单位

42. 酶活性浓度的单位 • 酶活性单位 • 惯用单位，国际单位（IU），Katal单位; • 酶活性浓度单位 • 酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示。U/L。

43. 正常上限倍数 • 正常上限升高倍数（upper limits of normal, ULN） • 是指把酶测定值转换为正常上限值的倍数。简单地说，就是用测得的酶活性结果除以参考范围的上限值。

44. 酶质量浓度的测定

45. 酶浓度 • 严格来说是指酶分子的质量浓度，常以酶蛋白浓度来表示。人体体液中的酶有几百种，除LPS、LCAT、ChE、铜氧化酶（CER ）外，大多数酶的含量在μg/L水平甚至更低。因此，酶活性浓度的测定是目前主要测定方法。 • 20世纪70年代以后，随着新技术特别是免疫学技术的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶蛋白质量的新方法。

46. 酶蛋白浓度测定的方法 • 国内外曾使用电泳法、柱层析法、免疫化学法等测定酶浓度，其中以免疫化学法应用较广。 • 免疫化学法是利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体后用免疫学方法测定酶浓度。

47. 酶浓度测定的免疫化学方法 • 免疫抑制法、免疫沉淀法、放射免疫测定（RIA）、化学发光免疫测定（CLIA）、酶免疫测定（EIA）、荧光酶免疫测定（FEIA）等。 • 其中，前两种方法可用于酶活性浓度测定，其他方法则用于酶蛋白浓度测定。 • 例如，如免疫抑制法测定CK-MB的活性、免疫沉淀法（单向扩散法）法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性；RIA测定胰蛋白酶和弹性蛋白酶浓度、CLIA测定CK-MB的浓度、ELISA测定神经元特异性烯醇化酶（NSE）浓度等。

48. CK-MB • 是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。 • 近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度（Mass）的方法。 • CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、FEIA等方法测定。

49. CK-MB • 这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测限<µg/L）和准确性好的特点，明显优于其他分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛接受。 • 为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。

50. 注意 • 由于酶浓度测定方法的不同，报告方式也有差异 • 酶活性浓度单位常以U/L报告， • 酶质量（mass）浓度单位常直接用ng/ml或g/L报告。