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光合细菌在生物产氢技术中的应用及菌种改造. 周 志 华 中科院上海生科院植生生态所 合成生物学重点实验室. 报告内容. 光合细菌的特性 光合细菌产氢原理与优势 产氢光合细菌的筛选 光合细菌与暗发酵产氢的互补性 光合细菌利用不同底物的产氢效率 产氢光合细菌的遗传改造. 光合细菌的类型. 紫色非硫细菌 红螺菌科. 紫细菌 红螺菌亚目. 紫色硫细菌 着色菌科. 绿色硫细菌. 光合细菌. 绿细菌 绿菌亚目. 多细胞丝状绿细菌. 蓝细菌. 光合细菌的共性. 同时进行光合作用和固氮作用. 紫细菌和绿细菌的共性. 不放氧光合作用 循环光合磷酸化.
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光合细菌在生物产氢技术中的应用及菌种改造 周 志 华 中科院上海生科院植生生态所 合成生物学重点实验室
报告内容 • 光合细菌的特性 • 光合细菌产氢原理与优势 • 产氢光合细菌的筛选 • 光合细菌与暗发酵产氢的互补性 • 光合细菌利用不同底物的产氢效率 • 产氢光合细菌的遗传改造
光合细菌的类型 紫色非硫细菌红螺菌科 紫细菌红螺菌亚目 紫色硫细菌着色菌科 绿色硫细菌 光合细菌 绿细菌绿菌亚目 多细胞丝状绿细菌 蓝细菌
光合细菌的共性 同时进行光合作用和固氮作用 紫细菌和绿细菌的共性 不放氧光合作用 循环光合磷酸化
紫细菌的五种生长方式 生长方式 光合自养 光合异养 化能自养 化能异养 厌氧发酵 碳源 CO2 有机物 CO2 有机物 有机物 能源来源 光合磷酸化 光合磷酸化 硫化物或氢 氧化磷酸化 底物水平磷酸化 需氧状况 厌氧 厌氧 好氧 好氧 厌氧
生物制氢技术的意义 氢气是最清洁能源、能量密度高、适合分布型供能，将是未来理想的终端能源载体 美国能源部未来制氢技术的重点发展方向： 模拟或利用生物产氢途径
光能 H＋和电子 H＋(膜外) 光合中心 生物合成与菌体生长 吸氢 酶 ATP ATP酶 CO2 H＋ H2 H2 有机底物 H＋ 固氮酶 TCA循环 电子 固氮酶 2Ｈ++2e+4ATP Ｈ2+4ADP 紫细菌产氢-光发酵产氢原理
光发酵产氢的优势 acetate + 2H2O → 2CO2+ 4H2 butyrate + 6H2O→4CO2 +10H2 glucose + 6H2O→ 4CO2 +10H2 • 底物的全程利用 • 高转化效率; • 无副产物产生; • 处理废水; • 氢气浓度高; • 利用太阳光;
Different Nitrogen Source Different Concentration (mM) Total H2 (ml/35mL) conversion efficiency of substrate (%) OD (660nm) L-Glutamate (NH4)2SO4 Ethanolamine Control 3.5 5.0 7.0 10.0 15.0 2.0 3.5 5.0 7.0 2.0 3.5 5.0 10.0 0 80±7 95±5 123±2 66±5 37±5 72±2 25±1 17±2 0±0 97±2 82±3 77±2 62±1 0 51.28 60.80 78.73 42.30 23.68 56.47 16.00 11.05 0 62.08 52.48 49.35 39.74 0 1.54 1.98 2.35. 2.25 2.82 1.30 2.19 2.39 2.57 1.15 1.79 1.89 2.25 0.31 菌株ZX-5利用不同氮源的产氢效率
+ 暗发酵产氢与光发酵产氢的互补性 光发酵细菌 暗发酵细菌 氢酶 固氮酶 C6H12O6→C3H7COOH+2H2+2CO2 C3H7COOH+6H2O → 10H2+4CO2 暗发酵产氢 光发酵产氢 C6H12O6+ 6H2O→ 12H2+ 6CO2
After dark-fermentation After photo-fermentation A process of sequential dark-and photo-fermentation The concentration of volatile acids in fermentation effluent 暗－光发酵耦联产氢技术 厌氧发酵菌
100 7.5 80 7.0 60 6.5 Cumulative hydrogen production(mL) Final pH 40 6.0 20 5.5 0 5.0 1:0 1:1 1:2 1:4 1:6 0:1 Inoculation Ratio (anaerobic bacterium : ZX-5) Hydrogen Volume Final pH 暗－光发酵细菌共培养产氢技术
Substrate concentration （g/l) Final PH inoculation rate Expected yield （molH2/mol glucose) achieved Hydrogen yield 11.43 7.13 0.83 5.35 5.194 通过主因素获得共培养产氢的最佳工艺参数
课题组过去五年内利用各种生物质的产氢研究 产氢量 L/L废水或/kg废弃物 25.0 20.0 13.4 671 810 生物质 琥珀酸生产废水 乙醇发酵废水 生物柴油生产废水 厨余垃圾 木薯粉 生物产氢技术 光发酵 暗光耦联 光发酵 暗光耦联 暗光耦联 COD 去除率% 87.6 84.6 91.2 84.3 80.2 Tao Y et al. 2007 Int J of Hydrogen Energ 32 Tao Y et al. 2008 Int J of Hydrogen Energ 33 Zong w et al. 2009 Biomass and bioenergy 33 Tao Y et al. 2010 Int J of Hydrogen Energ 35
进一步提高光合细菌产氢效率的途径 光合作用提供ATP 有机酸提供电子 光合作用系统 电子传递链 固氮酶表达活性 PHB合成途径 吸氢酶表达活性
影响光发酵产氢效率的主要功能基因 固氮酶基因及其调控基因 谷氨酰胺合成酶基因 吸氢酶基因及其调控基因
hupR 建立产氢光合细菌的遗传操作系统 敲除吸氢酶基因 hupSL基因及其打靶质粒的构建示 5kb 双交换子的Southern Blot鉴定 hupSL双交换子PCR鉴定 hupSL打靶质粒的酶切图
过表达敲固氮酶正调控基因nifA Marker 1 2 3 4 Marker 1 2 2kb nifA克隆至广宿主载体pMP220及转入类球红细菌的鉴定 nifA在光合细菌中的过量表达 基因工程改造菌株的产氢情况 Liu T et al. Int J of Hydrogen Energin press
Different Nitrogen Source Different Concentration (mM) Total H2 (ml/35mL) conversion efficiency of substrate (%) OD (660nm) L-Glutamate (NH4)2SO4 Ethanolamine Control 3.5 5.0 7.0 10.0 15.0 2.0 3.5 5.0 7.0 2.0 3.5 5.0 10.0 0 80±7 95±5 123±2 66±5 37±5 72±2 25±1 17±2 0±0 97±2 82±3 77±2 62±1 0 51.28 60.80 78.73 42.30 23.68 56.47 16.00 11.05 0 62.08 52.48 49.35 39.74 0 1.54 1.98 2.35. 2.25 2.82 1.30 2.19 2.39 2.57 1.15 1.79 1.89 2.25 0.31 菌株ZX-5利用不同氮源的产氢效率
铵对固氮酶表达活性的调控机制 GS/GOGET途径 glnA:谷氨酰胺合成酶基因
7kb 4kb 3kb 5.1kb B C A glnA1基因的敲除 A restrict enzyme mapping of glnA1 targeting plasmid B PCR verification of double crossover recombinant arrows show the correct bands C Southern Blot verification of double crossover recombinant
glnA1缺失突变株的产氢效率 Li X et al. 2010 Biotechnology and Bioengineering 106
总结 • 通过筛选可以获得利用各种底物包括废水高效产氢的紫色非硫细菌; • 通过暗－光发酵耦联或暗－光发酵细菌共培养可以大幅度提高产氢效率; • 通过敲除吸氢酶基因和过表达固氮酶正调控基因，产氢效率可以20％; • 通过敲除谷氨酰氨合成酶基因，可以完全解除铵阻遏效应，在高铵条件下恢复产氢;
