1 / 12

Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения

Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения. Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

devin-cooley
Download Presentation

Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики Кириллова Мария Александровна Руководитель: к.б.н. Есимбекова Е. Н. Красноярск 2012

  2. Микробная загрязненность - показатель санитарного качества продуктов питания, воды, чистоты поверхностей Методы определения микробного загрязнения: • Микробиологические • Биолюминесцентный метод, основанный на измерении АТP • Биолюминесцентный метод, основанный на измерении FMN http://biotest-by.com/

  3. Цель • Разработать метод анализа микробного загрязнения с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий, основанный на определении количества FMN в образце.

  4. Материалы и методы • Исследуемый объект • Escherichia Coli (BL21 codon Plus (DE3) RIPL), выращенные в лаборатории Фотобиологии ИБФ СО РАН на среде LB без антибиотиков в течение 18 часов при 30ºС. • Образцы бактерий исследовали в стационарной фазе роста. • Оптическая плотность при λ=590 нм D=6,4; 1 ед.опт.пл.=5*108 клеток/мл Реакционная смесь • 0,05 М фосфатный буфер • комплекс ферментов люцифераза - оксидоредуктаза • 0,0025% тетрадеканаль • 5*10-5 ÷10-3 М NADH • 5*10-8÷10-6 М FMN NADH:FMN-oxidoreductase (R) NAD(P)H + H+ + FMN  NAD(P)+ + FMNH2 Luciferase (L) FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2О+ h h Колонии E. coli Люминометр LumatLB9507

  5. Калибровочная кривая для определения FMN Максимальная чувствительность биферментной системы 1,2*10-9 М FMN

  6. Анализируемые образцы Escherichia Coli (штамм BL21) • Образец №1. Интактные клетки • Образец №2. Клетки, разрушенные ультразвуковым дезинтегратором при частоте 44 кГц • Образец №3. Надосадочная жидкость после центрифугирования разрушенных клеток (5000 об/сек, 12 мин)

  7. Зависимость интенсивности свечения от количества бактериальных клеток (образец 2) Максимальная чувствительность биолюминесцентной системысоставляет 3,9 млн. бактериальных клеток

  8. Зависимость интенсивности свечения от количества бактериальных клеток (образец 3) Максимальная чувствительность биолюминесцентной системысоставляет 5 млн. бактериальных клеток

  9. Сравнение с АТР-системой Система светлячков Бактериальная система Предел обнаружения ФМН -1,2 ·10 -9М Предел обнаружения бактериальных клеток – 3,9 млн. кл /мл • Предел обнаружения АТР – 10 -14 М. • Предел обнаружения бактериальных клеток – 1000 кл / мл

  10. Санитарные правила и нормы

  11. Выводы • Для анализа бактериальной загрязненности образец достаточно подвергнуть разрушению ультразвуковым дезинтегратором • Предел обнаружения бактериальных клеток –3,9 млн. кл /мл • Чувствительность метода ниже чувствительности АТР-системы на 3 порядка

  12. Перспективы • Возможна разработка биолюминесцентного метода анализа бактериальной загрязненности, основанного на измерении NADH • Предварительно полученные результаты указывают на высокую чувствительность биолюминесцентного метода к NADH (до 1·10-13 М), что сравнимо с чувствительностью люциферазы светляков к АТФ • В дальнейшем планируется для упрощения процедуры проведения анализа разработка иммобилизованного ферментного препарата

More Related