细胞周期调控异常

1. 细胞周期调控异常 医学院 病理生理教研室 刘 进 军

4. 一、细胞周期的基本概念 细胞增殖周期通常简称细胞周期(cell cycle)，是指细胞从上一次细胞分裂结束到本次分裂终了的过程或间隔时间。根据细胞周期不同时相的特点，可将细胞周期顺序分为4个连续阶段，即G1期（gap phase l)、S期(synthesis phase)、G2期（gap phase 2)及M期(mitotic phase)。

6. 细胞周期的特点有： • 单向性 即细胞只能沿G1→S→G2→M方向推进而不能逆行 • 阶段性 在4个连续的时相中，细胞的形态与代谢特点有较明显的差异，细胞可因某种原因在某时相停滞(arrest)下来，待生长条件好转后，细胞可重新活跃起来过渡到下一时相。

7. G1期 G1期是指从上一次有丝分裂完成到本次DNA复制之前的过程，持续时间一般为6～l2h。在G1期有mRNA和蛋白的合成，G1期细胞的主要任务是积累能量和原料，为DNA的复制作准备，故又称DNA合成前期。 • S期 S期即DNA合成期，持续时间一般为6～8h。S期末DNA含量增加1倍，细胞由二倍体变为四倍体。S期DNA的复制极其准确，每一段DNA只复制一次，从而可保证分裂后子细胞的遗传物质平均分配。S期DNA复制的起始存在“开启”和“关闭”机制(“on-of”switch)。DNA合成前设“检查点”(check point)。

8. G2期 G2期是指从DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间，持续时间一般为3～4h。只有完成了所有DNA复制后，细胞才进入G2期，故G2期又称DNA合成后期或丝裂前期。在G2期RNA和蛋白质合成活跃，有丝分裂所需的蛋白质、微管蛋白是在G2期合成的。此外，还进行线粒体的复制。 • M期 M期即有丝分裂期，细胞进行分裂，一般持续时间为lh。M期是很复杂的过程，根据光镜所见，可顺序分成6个阶段，即前期(Prophase)、前中期(early metaphase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)、末期(telophase)和胞质分裂期(cytokinesis)。 除M期外，其他各期都有生物大分子合成。前一期进行的生物合成为过渡到下一期做好准备。

9. G0期 G0是指分裂后相对稳定的一段时期，也称静止期(resting or quiescent phase)。所谓G0期不包括在细胞周期之内。细胞在适宜刺激下能被触发从静止状态进人增殖周期，G1期细胞在一定条件下也可退入G0期。 近年来的研究表明，G0期细胞并不"静止"，而是进行着极为复杂的生化反应。

10. 细胞周期的4个阶段及其与G0期的关系

11. 早期胚胎细胞的细胞周期 早期胚胎细胞周期主要指受精卵在卵裂过程中的细胞周期。 由于卵细胞在成熟过程中已经积累了大量的物质基础，基本可以满足早期胚胎发育的需要，因此早期胚胎细胞周期的G1和G2期非常短，以致认为其仅含有S期和M期。 非洲爪蟾受精卵前12个细胞周期共需8h，而其体细胞的细胞周期持续时间约24h。

12. G1 S M S G2 M 非洲爪蟾体细胞周期和早期胚胎细胞周期比较

13. 二、细胞周期的驱动力量――cyclin和 CDK的磷酸化和去磷酸化 细胞周期的程序控制主要通过各种细胞周期蛋白(cyclin)和依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)有序地磷酸化和去磷酸化，从而控制cyclin-CDK复合物的活性来实现的。 在各阶段还可以分别处理来自细胞内外的各种信息并作出相应的应答。组成这一自动程控机器的成分还有细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor，CDI)、磷脂酶和遍在蛋白/泛素(ubiquitin)。

14. cyclin cyclin，目前一般译为周期蛋白或周期素，因其在细胞间期连续合成不断积累而活性出现周期性变化而得名，cyclin是一组结构类似、能结合并调节CDK的蛋白质，统称为cyclin家族，目前知道的有8种成员，即cyclinA、B、C、D…H。每一种cyclin有若干亚型，如D型包括Dl、D2和D3。周期蛋白在细胞周期的不同时相程序性合成与释放。它们作为调节亚基，需与不同的催化亚基(CDK)结合形成复合物(cyclin-CDK)，从而通过对功能蛋白的磷酸化修饰，控制细胞周期的进行。

15. 1. cyclin A 用微注射法将cyclin A注射给非洲蟾蜍(Xenopus)卵母细胞可以促进后者成熟。人cyclin A在S期与CDK2结合参与调控DNA复制;与cdc2结合参与G2/M过渡。 2. cyclin B 人cyclinB基因于1989年由Hunter等克隆成功。cyclinB-cdc2复合物是成熟促进因子MPF(maturation-promoting factor)或称M期促进因子(M phase-promoting factor)的重要组成部分。 3. cyclin C cyclin C主要在G1/S起作用。它的催化底物及其本身的功能还不完全清楚。cyclin C的基因可能是p53蛋白的靶标。

17. 4. cyclin D 有D1、D2、D3三种，其表达在某些细胞有相对组织特异性。 cyclin D的特点为产生快、衰变快(半衰期不足30min)，是细胞外生长信号的“探测器”。只要生长因子存在，D型cyclin就维持中等程度的表达，而在G1/S交界处达高峰。一旦生长因子(如CSF-l)去除，D型cyclin就立刻消失，不管细胞处在何期。D型cyclin的表达始于G0/ G1交界处，其活性直到G1中期才显示出来，对G1/S转换起重要作用。

19. 丝裂原刺激 p27 B E A D G2 G0 G1 S G2 M G1 S M G0 图2. 细胞受丝裂原刺激后合成cyclin的时序和相对浓度

20. cyclinD通过与不同的蛋白结合可表现出截然不同的生理作用，它的结合物有CDK2、CDK4、CDK5、增殖细胞核抗原(PCNA)及p2l等。cyclinD通过与不同的蛋白结合可表现出截然不同的生理作用，它的结合物有CDK2、CDK4、CDK5、增殖细胞核抗原(PCNA)及p2l等。 应用显微注射，注入cyclinD抗体以阻断其功能的研究中发现：当G0期细胞在生长因子接触后10～12小时阻断cyclinD功能，细胞不能进入S期，但生长因子接触后14～16小时注入则不影响细胞进入S期。 提示cyclinD是细胞通过“限制点”所必需的。

22. 5. cyclinE l991年克隆出人cyclinE的基因。cyclinE在G1晚期到S早期与CDK2结合成复合物而参与G1/S转换。 6. cyclinF与cyclinG cyclinF和cyclinG的氨基酸组成与cyclin A部分类似。其功能尚不清楚。cyclin G是已知的唯一受到p53调控的细胞周期蛋白。

23. 7. cyclinH 哺乳动物细胞的cyclinH是CDK活化激酶(CDK-activatjngkinase，CAK)的调节亚基，帮助CAK催化p34的第161位苏氨酸残基发生磷酸化。 8. 增殖细胞核抗原 增殖细胞核抗原(PCNA)也是一种周期蛋白，但它不与CDK结合，而是作为DNA聚合酶的附属蛋白，促进DNA聚合酶延伸DNA。它在S期浓度最高，可作为S期标志物。

24. CDK家族 CDK是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，目前发现有9种成员，有不同程度的同源性，故称CDK家族，各成员命名为CDK1，2，3…9。CDK含催化亚基，但需要cyclin提供调节亚基才有活性。通常以cyclin-CDK复合物形式出现。 CDK的上游尚有CDK活化激酶(CDK-activating kinase，CAK)。CDK也能与CDI结合，而抑制细胞周期。此外，CDK自身的磷酸化状态与其活性也密切相关，如CDK中的苏氨酸(T)残基和酪氨酸(Y)残基磷酸化，可使CDK激活，而活化的Thr残基发生去磷酸化则使CDK失活。

25. 1. CDK1 CDK1又称cdc2。研究酵母的细胞周期调控时找到了许多对温度极敏感的突变株。温度的变化，可使细胞周期停止进行。分离出可阻断细胞周期的基因，命名为cdc(cell division cycle gene)。后来在哺乳动物(包括人)细胞中也找到了一些控制细胞周期的基因，这些基因在进化上高度保守，如酵母的cdc2与人的cdc28结构类似，编码产物是相对分子质量为34000的蛋白质，一般表示为p34cdc2/cdc28。

26. p34蛋白与CDKl的激酶功能区完全一样，所以认为cdc2编码蛋白就是CDKl。p34是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在不同时相与不同的蛋白结合，表现出不同的功能。p34对G1/S转换和G2/M转换都是必需的。p34与cyclin B结合成的复合物是成熟促进因子(MPF)的重要组分，对驱动细胞进入M期至关重要。 1991年冷泉港(Cold Spring Harbor)实验室发起的一次细胞周期研讨会上决定把cdc2命名为CDK家族的第一号，即CDKl。

27. 2. CDK2 1991年克隆出非洲蟾蜍和人的CDK2基因。CDK2活性于G1晚期开始升高，在S期和M期达高峰，CDK2对G1/S转换是必需的。CDK2的晶体结构已阐明。 3. CDK3 CDK3对G1期的驱进有推动作用。其相应的调节亚基尚末鉴定。

28. 4. CDK4 CDK4主要与D型cyclin结合。Dl-CDK4复合物在G1/S交界处含量升高，而在S期下降。CDK4与CDKl、CDK2、CDK3及CDK5均不同，它不能使组蛋白H1磷酸化。 5. CDK5 在分裂后的神经元有CDK5，其基因虽已克隆成功，但其功能尚不明确。 6. CDK6 CDK6与D型cyclin结合。主要表达于淋巴细胞。

29. 表1 细胞周期素及与之对应的CDKs

30. 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 (cyclin dependent kinase inhibitor，CDI) CDI是CDK的抑制物，通过与CDK非共价结合而抑制CDK活性的，是与cyclin-CDK作用相对抗的重要机制之一，参与细胞周期检查机制。哺乳动物细胞的CDI主要包括Ink4、Kip及GADD45等。 Ink4(inhibitor of CDK4的缩写)是一族CDK4的特异性抑制蛋白，只特异性抑制CDK4、 CDK6。第一个被鉴定的成员为p16，其他成员有pl5、p18及pl9。 Kip即kinase inhibition protein的缩写，包括p2l、p27及p57。

31. l. pl6 p16基因又称为多肿瘤抑制基因l(multiple tumor suppressor l，MTSl), 在S期达高峰。p16蛋白与cyclinD竞争CDK4或CDK6从而控制cyclinD/CDK4或cyclinD/CDK6复合物的形成与活性。 这种负性反馈调节机制有利于确保基因组DNA稳定，其功能的丧失意味着细胞周期运转机器刹车装置失灵，可能因此导致肿瘤的发生、发展及恶化，在Rb基因缺失情况下，pl6水平增高，故有人认为pl6是一种抑癌基因。

33. 2. pl5 p15基因又称多肿瘤抑制基因2(MTS2)，定位于9p21，与p16基因相毗邻。p15蛋白与p16有90%同源性。p15含137个氨基酸，能与CDK4结合，抑制其与相应的cyclin结合。经TGF-β处理的人角化细胞，pl5表达增高30倍

34. 3. p21 p2l是作用强度较大、作用谱较广的一种细胞周期抑制蛋白。 p2l通常也写作p2lCip/Wafl/Sdil/Picl，右上角的Cipl，Wafl，Sdil，Picl等表示其来源或最早得到发现的途径。 ⑴ p2l的发现 Elledge等人(1992年)用酵母CDK2筛选人蛋白，得到CDK交互作用蛋白(CDK interacting protein，Cipl)。与此同时，Vogelstein等用杂交法比较含野生型p53基因和突变型p53基因细胞申的mRNA，得到一个cDNA，后者是可被野生型p53活化表达的基因，故称Wafl(wild-type-p53-activated fagment)基因。几乎同时，另外一个实验室(Kinsella等人)从静止的人类衰老细胞中找到了一种能阻止细胞生长的Sdil (senescent cell-derived inhibitor 1)基因。细胞静止时Sdil mRNA增加10-20倍，血清刺激后短暂升高，在S期前降低。以后证实上述3种基因和蛋白质序列及功能相同，统称为Picl(p53-regulated inhibitor of CDK)。 但必须强调指出p2lCip/Wafl/Sdil/Picl和细胞癌基因ras产物p21ras毫不相干。

35. ⑵ p21的基因及蛋白质结构与定位 p21基因为单拷贝基因，约85kb，p21蛋白定位于细胞核中，富含精氨酸。N末端为cyclin结合区，与cyclinD、E结合，C末端为PCNA结合区中间第49-72位氨基酸是CDK2结合区。人与鼠p21一级结构有79%的同源性，提示p21在哺乳动物物种进化过程中高度保守。

36. ⑶ p2l的功能 ① 在G1期p2l抑制cyclinD-CDK4、cyclin A-CDK2 及cyclinE-CDK2，pRb不能发生磷酸化，细胞停滞于G1期，利于细胞进行修复。但p2l对cyclinB组成的复合物的抑制活性较弱。p2l与p27有协同作用。 ② 通过与PCNA结合使PCNA不能与DNA聚合酶δ形成复合物，或使DNA全酶复合物不能在模板DNA单链上滑动，影响DNA的复制。 ③在细胞应激时，p2l通过抑制应激激活蛋白激酶(stress-activated protein Kinase，SAPK)的活性，认为p2l参与细胞应激状态时的信号转导。

37. cyclin CDK2 PCNA N C P21 蛋白的功能区域示意图 功能：主要在G1和G1-S期的转变阶段抑制cyclin-CDK活性 。 通过与PCNA结合影响DNA的“复制” 通过抑制SAPK参与应激时的信号转导 调节：p53依赖途径（p53作为转录因子启动p21表达） 非p53依赖途径（佛波脂、丫啶橙等可诱导p53－/－人类白细胞株 的p21表达。

38. 4. p27 p27与cyclin-CDK结合成复合物，对后者有无抑制作用主要取决于p27的量，以化学剂量方式起作用。Go期细胞p27水平较高，从Go期到S期逐渐降低，在经过一个临界值后失去对cyclinD-CDK4或cyclinD-CDK6的抑制作用。p27主要受细胞外刺激诱导表达。 p27的作用特点: ①非特异性，p27可抑制所有CDK的活性;②化学剂量依赖性。

39. 5. GADD45 GADD(growth arrest and DNA damage inducible)基因家族包括5个成员。GADD45对DNA损伤物质的诱导反应非常敏感，即使低剂量放射损伤即可诱导其表达。 GADD45将细胞阻滞于G1期，利于维持基因组DNA的稳定性。在癌前病变、遗传性运动失调性毛细血管扩张症，GADD45对放射损伤DNA诱导的应答存在缺陷。

40. 图1.cyclin、CDK及CDKI 相互关系

41. 内源性增殖抑制因子 抑制因子是细胞中产生的，具有组织特异性的，抑制生长 的调节分子，作用于细胞本身。有人称其为“抑素”。具有 以下性质： • 无论在体内或体外，均能抑制有丝分裂，具有组织特异性 • 无种间差异 • 制造抑素的组织即是该抑素作用的靶组织 • 对有丝分裂的作用是可逆的，对细胞无损害作用

42. 蛋白磷酸酶 蛋白磷酸化与脱磷酸化几乎涉及所有生理过程:从胚胎发育到细胞的生长发育、分裂分化、基因表达甚至癌变等。 它是使cyclin-CDK的靶分子去磷酸化的酶，其作用与cyclin-CDK相反。例如蛋白磷酸酶I(PPl) ，它在M期使Rb蛋白发生去磷酸化。ＰＰ2Ａ主要在Ｇ2/Ｍ相过渡和Ｍ期的终止时参与一系列磷酸化的过程,阻止细胞进入有丝分裂期。

43. 以遍在蛋白为中介的蛋白水解体系 cyclin的浓度依细胞周期而变化，其产生取决于mRNA的转录与蛋白质的合成，其降解则需要蛋白水解体系，这种水解是以遍在蛋白(泛素)为中介的。遍在蛋白是高度保守的小分子蛋白。cyclin被分解时，先在一种特定的连接酶作用下，遍在蛋白连接到cyclin分子特定的位点，然后由依赖遍在蛋白的蛋白水解酶作用，将cyclin连同遍在蛋白一起水解掉。

45. 酵母cdc34和UBC9(UBC为ubiquitin-conjugating的缩写)基因编码2个遍在蛋白的连接酶，cdc34编码产物在S期将遍在蛋白与G1期cyclin即Clnl和Cln2等连接，帮助蛋白水解酶分解这些cyclin;而UBC9产物在M期将遍在蛋白与Clb连接，帮助蛋白水解酶分解这些因子。酵母cdc34和UBC9(UBC为ubiquitin-conjugating的缩写)基因编码2个遍在蛋白的连接酶，cdc34编码产物在S期将遍在蛋白与G1期cyclin即Clnl和Cln2等连接，帮助蛋白水解酶分解这些cyclin;而UBC9产物在M期将遍在蛋白与Clb连接，帮助蛋白水解酶分解这些因子。 所以，泛素中介的蛋白水解体系异常与细胞周期异常及肿瘤发生也有一定关系。

46. E2F E2F是一类细胞转录活化因子，因首先发现它可激活腺病毒E2启动子而得名。已发现E2F有5个成员，即E2F-l~5。E2F通常以与其他蛋白质形成复合物的形式存在，只有少数细胞株(如HeLa细胞)含有大量游离形式的E2F。许多DNA合成基因和细胞生长控制基因的启动子中都存在E2F的结合位点，E2F可直接活化这些基因，启动DNA合成，从而使细胞进入S期。

48. E2F功能区与pRb(或RB相关蛋白p107和p130)结合后，其功能区被遮盖，从而使其活化转录功能被抑制。也就是说，E2F因与pRb结合而失活。但只有去磷酸化状态的pRb才能结合和抑制E2F，诱导细胞阻滞于G1期。磷酸化状态的pRb则不能抑制E2F的功能，从而使细胞由G1期进入S期。 p107（pRb相关蛋白）有丝(苏)氨酸蛋白激酶活性，与CDK2结合，使之磷酸化，抑制其活性。pl07通过与E2F4结合调控转录。

49. 三、细胞周期的检查机制 细胞周期最主要的任务是将其基因组DNA在DNA合成期(S期)完整地复制成两份拷贝,然后在分裂期(M期)将这两份拷贝正确无误地分配给两个子代细胞。细胞在长期的进化过程中发展出了一套保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制,通常被称为细胞周期检查点(check-point)。

50. 细胞检查机制的含义是细胞周期内部事件的有序进行基于一种依赖关系，即下游事件的启动依赖于上游事件的完成，当下游事件完成后产生一个信号，然后由细胞周期上游的应答元件作出反应，故也称为反馈机制。细胞周期检查机制障碍与肿瘤、衰老、凋亡等的发生有密切关系。细胞检查机制的含义是细胞周期内部事件的有序进行基于一种依赖关系，即下游事件的启动依赖于上游事件的完成，当下游事件完成后产生一个信号，然后由细胞周期上游的应答元件作出反应，故也称为反馈机制。细胞周期检查机制障碍与肿瘤、衰老、凋亡等的发生有密切关系。