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PMF の原理と Mascot の使用法

8 / 18 (1 日目 ). PMF の原理と Mascot の使用法. 情報理工学系研究科 コンピュータ科学専攻 田中　文昭 ( fumi95 @is.s.u-tokyo.ac.jp ). PMF (peptide Mass Fingerprinting) とは？. 断片化したペプチドの質量分析を利用して，元のタンパク質を同定する方法. プロテアーゼ による断片化. 液クロ 電気泳動. 質量分析装置へ. 質量ピークデータ. データベース との照合 元のタンパク質 の同定. VQKI ・・・ TYDK ・・・. VQKI ・・.

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PMF の原理と Mascot の使用法

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Presentation Transcript

  1. 8 / 18 (1日目) PMF の原理と Mascot の使用法 情報理工学系研究科 コンピュータ科学専攻 田中　文昭 (fumi95@is.s.u-tokyo.ac.jp)

  2. PMF (peptide Mass Fingerprinting)とは？ • 断片化したペプチドの質量分析を利用して，元のタンパク質を同定する方法 プロテアーゼ による断片化 • 液クロ • 電気泳動 質量分析装置へ 質量ピークデータ • データベース • との照合 • 元のタンパク質 • の同定 VQKI・・・ TYDK・・・ VQKI・・ VQK・・ ITDK・・ m/z ・・・ ・・・ = 質量値 = 質量/電荷数 複数の タンパク質 1種類の タンパク質 断片化されたペプチド 生物情報科学実験I (質量分析(MS)によるタンパク質の解析) 8/14(木), 15(金) 今回の演習 8/18(月)~20(水)

  3. プロテアーゼによる断片化 • Trypsin (トリプシン)がよく用いられる MVKLATKNCRCIY ミスカット MVK LATK NCR CIY MVKLATK LATKNCR NCRCIY MVKLATKNCR LATKNCRCIY ・・・ ミスカット数 2 ミスカット数 0 ミスカット数 1

  4. 質量分析の概要 試料 ESI, MALDI イオン化 Ionization フラグメント Sector MS, QMS TOFMS, FT-ICRMS 質量分析 Mass analyzer マススペクトル

  5. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 MALDI MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization 紫外線レーザー • 分子量100万程度までの分子について測定可能 • 試料量は数フェムトモルから測定可能 • 紫外線吸収性の固体マトリックスを使用(CHCA 等) 可動ターゲット 質量分離部へ 試料 イオン引き出し電極

  6. 飛行時間型質量分離装置 TOFMS イオンを加速してから検出器に到達するまでの時間を測定する。 イオン反射器を用いることで、運動エネルギーのぶれを打ち消すことで、高い分解能をもったスペクトルを得ることができる。 • 飛行時間から質量値を測定する 検出器 検出器 イオン反射器

  7. MALDI-TOFMS による質量分析の結果（例） m/z

  8. 質量ピークデータは http://nicosia.is.s.u-tokyo.ac.jp/~fumi95/PMF/ 　　 からダウンロードして下さい． （※ 8/14(木), 15(金)の演習に参加した方は， 　　　　 各自で測定したデータでも構いません） Mascot を使ってタンパク質の同定をしてみよう！ peak.txt 524.196542 532.242459 550.172395 m/z ・・・・・

  9. Mascot の使い方 http://www.matrixscience.com/search_form_select.html メールアドレス ユーザ名 タイトル データベース 許容ミスカット数 生物種 消化酵素 化学修飾 （100% の修飾率） 化学修飾 （100% 未満の修飾率） データファイルへのパス 許容質量誤差

  10. Mascot の使い方 • 設定項目 • Your name : 任意 • Email : 各自のメールアドレス（存在しないアドレスは無効） • Search title : 任意 • Database : SwissProt • Taxonomy : Homo sapiens (human)※変更可 • Enzyme : Trypsin • Allow up to : 1 (missed cleavages)※変更可 • Fixed modifications : Carbamidomethyl (C) • Variable modifications : Oxidation (M) • Protein mass : 空欄 • Peptide tol. ± : 2 Da※変更可 • Mass values : MH＋ • Monoisotopic/Average : Monoisotopic • Data file : 測定データファイルへのパス

  11. Mascot の使い方 • Data fileの項目に、DL したpeak.txt をセット • 設定が完了したら、 「Start Search」ボタンを押す

  12. Mascot の使い方 • 検索結果① ヒットした蛋白質 分子量 スコア 理論値と一致した ペプチド数 候補の蛋白質がスコア順に並ぶ

  13. Mascot の使い方 • 検索結果②　第一候補の「ALBU_HUMAN」をクリックすると．．． ヒットした蛋白質 スコア 分子量 理論値と一致した ペプチド数 配列被覆率 赤字が 一致した箇所

  14. Mascot の使い方 • 検索結果③　前ページの続き 蛋白質上の位置 ピーク（理論値） ミスカット数 ピーク（観測値） ピーク誤差 配列

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