第五章 细菌的遗传分析

1. 第五章 细菌的遗传分析 • 真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过有性过程(减数分裂——受精)实现。细菌和病毒均属于原核生物不存在严格意义上的有性过程。 • 但细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因子(如噬菌体和质粒，也被称为核外或染色体外因子)，它们可以在细胞间传递，并且形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重组体。 • 这种重组体结构类似于真核生物减数分裂过程中形成的重组体结构。

2. 第一节 细菌的细胞和染色体 • 一、细菌细胞 细胞比较小，仅含有1-2条染色体，每条附着在细胞膜上的一定区域，无核膜，称拟核。细菌每20分钟繁殖一代 • 二、细菌染色体 大都是双链DNA环状结构，长度从25~35000不等，裸露，无蛋白质结合，也不形成核小体，所以其染色体的显著特点是：易于接受带有相同或不同物种的基因或DNA片段的插入。 大肠杆菌染色体DNA以折叠或螺旋状态存在，且依赖于RNA分子的作用。（P146）

3. 第二节 大肠杆菌的突变型及筛选 • 一、大肠杆菌的突变类型 （一）合成代谢功能的突变型（anabolic functional mutants) : 合成代谢功能(anabolic function):野生型（原养型）品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必须的复杂有机物的功能。 营养缺陷型：一个必需的基因发生了突变不能进行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现。 条件致死突变

4. （二）分解代谢功能的突变型（catabolic functional mutants):条件致死突变型。 分解代谢功能（ anabolic function）：野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，因为它能把复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能把复杂分子如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间产物。这些降解功能称~。 同样，一系列降解功能的实现也需要许多基因的表达，其中任何一个基因突变都会影响降解功能的实现。

5. （三）抗性突变型：细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗菌素产生抗性。（三）抗性突变型：细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗菌素产生抗性。 • 二、突变型的筛选 • 营养缺陷型的筛选、鉴定： • 选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养（补充）培养基上的生长表现将菌株分为原养型(也称为原生营养型)与营养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长)。 • 其它突变类型的筛选、鉴定： • 对于其它的突变类型(如温度敏感型)，也可以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。

6. 选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但要检测分离含有多种突变型的混和菌株，仅采用选择培养法要进行多次试验才能够达到目的、效率太低。选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但要检测分离含有多种突变型的混和菌株，仅采用选择培养法要进行多次试验才能够达到目的、效率太低。 • 为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计了影印培养法。 • 该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到不同选择培养基上同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。

7. 注意： • (1)最初的培养基必须是非选择性的，即各种突变型都能够在其上生长； • (2)必须采用适当的方法如涂布或划线法，以使培养物菌落之间要分开。

8. 影印培养法：

9. 第三节 大肠杆菌的性别 • 一 、大肠杆菌性别的发现 　大肠杆菌Ｋ12中有两个这样的菌株： A菌株：met-bio-thr+leu+thi+ B菌株：met+bio+thr-leu-thi- A strs菌株× B strr菌株 A strr菌株× B strs菌株 基本培养基 基本培养基 产生原养型 产生原养型 A strs菌株× B strr菌株 A strr菌株× B strs菌株 链霉素培养基 链霉素培养基 产生原养型 不产生原养型

10. 原因解释：菌株A相当于雄性，是遗传物质的供体（donor) ，而菌株B相当于雌性，是遗传物质的受体。所以在含有链霉素的培养基中， Astrs菌株× Bstrr菌株这一杂交组合可以得到原养型，原因是供体虽然对链霉素敏感，细胞不能分裂，但并不影响供体的基因转移；受体对链霉素有抗性，所以不影响细胞分裂，也不影响接受外源遗传物质发生重组，从而出现原养型菌落。而反交（A strr菌株× B strs菌株）就不能得到原养型，因为受体对链霉素敏感，虽然供体转移遗传物质，但受体细胞不能分裂，所以不能重组成原养型菌落。

11. 二、F因子与高频重组 大肠杆菌中供体与受体的区别：是否具有一种微小的质粒---F因子（F factor或 F element)，又称性因子或致育因子。供体含有F因子，此菌株就称为F+，受体不含F因子，此菌株就称为F-。 原点 转移起始点 致育基因 使它具有感染性，其中一些编码F纤毛（性馓毛） 配对区域 与受体染色体上同源序列配对，交换整合到受体菌中，成为受体染色体的一部分

14. F因子及其在杂交中的行为

15. F+品系称为低频重组（low frequency recombination，Lfr)：F因子转移频率很高，但两者染色体之间重组频率很低，大约是每百万个细胞发生一次重组。 • Hfr品系称为高频重组（ high frequency recombination，Hfr）：因为Hfr细胞与F-细胞接合后可以将供体染色体的一部分或全部传递给受体F-，当供体和受体的等位基因带有不同标记时，在她们之间就可以发生重组，重组频率可达到0.01以上。

16. 三、细菌重组的特点 Hfr细胞和F-细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的Hfr染色体也随之断裂，一般说很少有整条Hfr染色体转入F-细胞的，因此： （一） F-细胞得到的只是F因子的一部分，F因子其余部分依赖于整条Hfr染色体的转移，这样Hfr ×F-杂交中选出的大多数重组子仍为F-。 （二） F-受体细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞就称为部分二倍体（partial diploid)或称为半合子(merozygote)。供体与受体的重组是内基因子（ F-染色体DNA）与外基因子（ Hfr部分染色体DNA）的同源部分配对、交换，产生重组子。其中单交换产生的是不平衡的部分二倍体线性染色体，而双交换产生的是有活性的环状重组子和片段。

17. 细菌重组的特点 -- （a）：接合后形成的部分二倍体，包括外基因子和内基因子； （b）：内基因子和外基因子之间单交换形成一个线性染色体； （c）：双交换形成一个完整的重组染色体和一个游离片段，这一片段随以后的分裂而丢失。

18. 可见：原核类中的交换并不像真核生物那样在两整套基因组间进行，而是在一完整的基因组（ F-内基因子）与一不完整的基因组（ Hfr外基因子）间进行，即在部分二倍体间进行。因此，在细菌的重组中有下列两个特点： 1、只有偶数次交换才能产生平衡的重组子 2、不出现相反的重组子，所以在选择培养基上只出现一种重组子。

19. 第四节 中断杂交与重组作图 • 一、中断杂交实验原理 基因从Hfr 细胞按次序转入F-细胞，可根据基因进入F-细胞的时间和次序制作基因图谱。 Wollman和Jacob于1954年在大肠杆菌中曾进行了以下杂交实验： Hfr：thr+leu+azsTislac+gal+strs× F-:thr-leu-azrTirlac-gal-strr把接合中的细菌在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以中断接合中的细菌，然后分析受体菌的基因型，这是在大肠杆菌等细菌中用来测定基因位置的一种方法。

20. 二、中断杂交作图 中断杂交实验结果 不同基因在F-中出现的时间和达到的稳定转移频率不同，表明它们同转移起始点之间，以及它们之间的顺序和距离不同。

22. 0 5 10 15 20 25 min O az Ti lac gal E.coli中断杂交作图 基因距离以分钟为单位 • 同一个Hfr菌株的转移的起始点在以及转移顺序在不同实验中都是相同的。但一个F+品系可产生许多Hfr品系，这是因为F因子在细菌染色体上有许多插入位点而且其插入取向不同而形成的。用这些不同Hfr菌株进行中断杂交实验，则它们的转移起点、基因转移顺序以及转移方向都不相同。（P153图6-9）

23. 三、重组作图 • 如果2个基因间的转移时间<2min则用中断杂交作图不可靠，应采用传统的重组作图法。 ●杂交 Hfr lac+ade + ×F-lac- ade- lac +乳糖不发酵 ade-胸嘌呤缺陷型 用完全培养基但不加腺嘌呤，可选出F-ade+的菌落 ●由于lac+ ade-近，两者相继进入时间相距很短，难以准确界定，所以只能根据产物确定。 ●如果选出ade+同时也选出lac+，说明lac- ade 间没有发生过交换；如果是lac-ade+说明发生交换。

24. Hfr lac+ ade+ F- lac- ade- F- lac- ade- Hfr lac+ ade+ F- lac+ ade+ F- lac- ade- Hfr lac+ ade+ F- lac- ade+ F- lac- ade- A：外基因子与内基因子之间未发生重组；B： lac- ade 两基因之外发生双交换；C： lac- ade 两基因间发生交换产生重组子。 ●重组率=lac-ade+/(lac+ ade+)+(lac- ade+)×100% =22% • 两个位点之间的时间单位约为1min，可见1个时间单位（分钟）大约相当于20%的重组值 。 • 用重组率与中断杂交法测的基因距离大致符合的，根据接合的实验，用中断杂交法基因重组等方法已绘制出大肠杆菌K12环状遗传图（图10-17）。 A: B: C:

25. 第五节 F’因子与性导 一 F`因子与F`菌株 Hfr F+因子的时候，F因子偶尔可能获得细菌染色体的一部分,而保留着对遗传地点的“记忆”。这种带有部分细菌染色体的F因子称F’因子。当F’因子再整合到细菌染色体时，它就只能在原来的地点配对、交换而插入其中，而不能象F因子那样可以在任何位点整合。 F`菌株：指带有F`因子的细菌。

27. 二、性导 F’因子转入受体细胞后，由于引入体细胞的部分基因，从而形成部分二倍体，这种利用F’因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体的过程叫性导（sexduction或F’---duction ）

28. 第六节 转化与转导作图 • 一、转化(transformation) (一)、细菌转化实验 (二)、转化过程 *(三)、共同转化与遗传图谱绘制

29. 1. 基础知识 野生型肺炎双球菌(Strep-tococcus pneumoniae)菌落为光滑型，一种突变型为粗糙型，两者根本差异在于荚膜形成； 荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性； 不同抗原型是遗传的、稳定的，一般情况下不发生互变。 (一)、细菌转化实验

30. 2. Griffith转化研究(1928)

31. Griffith对其试验结论及发展 根据上述研究结果Griffith认为： • (有毒)死细菌中的某种物质转移到(无毒)活细菌中，并使之具有毒性，导致小家鼠死亡。 • 他将这种细菌遗传类型的转变称为转化，并将引起转化的物质称为转化因子(tranforming principle)。 • 但是当时的化学与生化分析技术还无法鉴定杀死细菌中的成分，因而不知转化因子为何物。

32. 以后一些研究者重复上述试验，并且加入了体外培养试验，即：将加热杀死的SIII细菌与无毒RII细菌混合培养，然后注入小家鼠体内，同样导致家鼠死亡。表明：以后一些研究者重复上述试验，并且加入了体外培养试验，即：将加热杀死的SIII细菌与无毒RII细菌混合培养，然后注入小家鼠体内，同样导致家鼠死亡。表明： • 细菌在培养条件下也能够实现遗传类型间的定向转化。

33. 3. 阿维利(Avery)等的转化实验(1944)

34. 实验结论 • 上述实验结果表明：来源于加热杀死的SIII细菌，并使 RII细菌转化成为SIII型细菌的转化因子是DNA。 • 正是在这一认识的基础上，将转化定义为：某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。

35. Avery等人的实验实际上也表明：决定细菌遗传类型的物质是DNA，即证明了DNA就是遗传物质。Avery等人的实验实际上也表明：决定细菌遗传类型的物质是DNA，即证明了DNA就是遗传物质。 • 但由于他们采用的实验方法当时不被人们广泛接受，而且得出的结论与当时人们的传统观念(认为蛋白质是遗传物质)不符合，而长期没有得到人们的承认。

36. (二)、转化过程 转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个共同特征，即： • 1. 感受态与感受态因子： • 感受态指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。

37. 感受态主要受一类蛋白质(感受态因子)影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。感受态主要受一类蛋白质(感受态因子)影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。 • 一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用Ca2+(如CaCl2)处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力。

38. 2.供体(donor)DNA与受体(receptor)细胞结合(binding)：2.供体(donor)DNA与受体(receptor)细胞结合(binding)： • 结合发生在受体细胞特定部位(结合点)； • 对供体DNA片段有一定要求(20000个核苷酸对）； • 结合过程是一个可逆过程。 • 3.DNA摄取： • 当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源DNA； • 往往只有一条DNA单链进入细胞(单链摄入)，另一条链在膜上降解。

39. 4.联会(synapsis)与外源DNA片段整合(integration)： • 整合就是指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地掺入到受体DNA中的过程。 • 实际上就是一个遗传重组的过程。因而研究整合的分子机制事实上也为遗传重组的分子机制作出了贡献。

41. *(三)、共同转化与遗传图谱绘制 • 利用共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理： • 相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正向关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。 • 因此可以通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。(P158)

42. 转化基因间重组值的计算 转化子数(重组体数) 亲组合数+转化子数 (+ -)+(- +) (+ +)+(+ -)+(- +) 重组值== 例:供体trp2+ his2+ tyr1+ trp2- his2- tyr1- P158 表6-5的重组值 trp2—his2的重组值=34% trp2—tyr1的重组值=40% his2—tyr1的重组值=13% 根据重组值作图： trp2 34 his2 13 tyr1

43. 二、转导 • 1. 定义：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程，称转导。 • 2. 发现 ●Lederbery及其研究生Zinder（1951）首先在鼠伤寒沙门氏菌（Salmenella typhimurium）中发现转导现象。     ●发现过程 他们用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌和甲硫氨酸、组氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌共同培养，相当让两种不同缺陷型的菌杂交。杂交过程和结果如下：

44. LT22 phe- try- tyr-        ×     LT2 met- his- （苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）    （甲硫氨酸、组氨酸） 营养缺陷型 ↓      营养缺陷型                      原养型的菌落（即出现个别正常型的细菌） • 那么这些原养型菌落的出现是由接合引起的？ 还是由转化引起的？ 他们先进行U形管实验（P159），结果在LT22一臂获得原养型的菌株，由此推测可能有一种可通过滤膜的过滤性因子（FA）在起作用。进一步利用DNA酶处理，结果FA不受DNA酶影响，从而消除了转化作用的可能性。最后认为FA是一种噬菌体，发现了转导。

45. 3. 转导的机制 转导是在噬菌体包装中因为错误将细菌染色体片段包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”而发生的。具体过程如下：   （1）噬菌体侵染细菌。 （2）噬菌体DNA使细菌染色体形成片段，合成噬菌体DNA和外壳。 （3）新噬菌体包装，偶尔将细菌染色体片段也包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”。“假噬菌体”和真噬菌体一起释放出来。

46. （4）“假噬菌体”和真噬菌体一样可再侵染细菌，其中“假噬菌体”侵染时，就将外来的细菌基因注入，经过基因重组改变遗传性状，完成转导的过程。 目前根据转导的机制，已广泛应用在体外包装“假噬菌体”，即将外源基因导入“假噬菌体”中，再侵染细菌，进行基因表达的研究。

47. （一）普遍性转导 普遍性转导：指P1、 P22等可以转导沙门氏菌染色体组的任何不同的部分。 如果两个基因始终是一起转导或同时转导（共转导或并发转导）频率较高，那么证明两基因连锁，而且频率越高，则两基因距离越近。 • 如：a基因和b基因共转导频率高， a和c共转导频率也高， b和c共转导频率低，则3个基因顺序为 b a c

49. 若同时观察3因子转导分析，则只做一次实验就可推出其次序。若同时观察3因子转导分析，则只做一次实验就可推出其次序。 举例：利用普遍性转导测知leu，thr，azi三个基因顺序。 方法： （1）用噬菌体P1侵染带leu+，thr+和azi+的大肠杆菌。 （2）用从该大肠杆菌释放出来的噬菌体，再侵染leu-、thr-和azi-的大肠杆菌。

50. (3)把受体菌接种到不含thr的选择培养基上对thr+进行选择，凡具thr+的细菌都可生长，把此菌接种到其他培养基上，结果在选出的thr+重组子只有3% leu+，但无一个同时也是azi+ 。若选择leu+重组子，则约有50%同时也是azi+，因此3基因次序应为 thr+ leu+ azi+。P160