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Replicación del DNA

Replicación del DNA. Dogma Central. replicación. transcripción. traducción. proteina. RNA. DNA. Transcripción inversa. Cromosomas Procariontes. Cromosoma lineal eucarionte. Características Generales de la Replicación. Semi-conservativa Bidireccional

dinesh
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Presentation Transcript

  1. Replicación del DNA

  2. Dogma Central replicación transcripción traducción proteina RNA DNA Transcripción inversa

  3. Cromosomas Procariontes

  4. Cromosoma lineal eucarionte

  5. Características Generales de la Replicación • Semi-conservativa • Bidireccional • Semi-continua ó semi-discontinua • Alta fidelidad

  6. Replicación semiconservativa

  7. Replicación bidireccional

  8. Replicación semidiscontinua la polimerización se lleva a cabo en dirección 5´--3´

  9. Replicación del DNA y ciclo celular

  10. Etapas de la Replicación I. Inicio: es el punto en donde se regula el proceso II. Elongación III.Terminación

  11. I. Inicio de la replicación Ori C Secuencia rica en T-A

  12. origen R Medio con antibiótico Minicromosomas para determinar el origen mínimo E. coli DNA cromosomal (E. coli) + Enzima de restricción DNA plasmídico + Enzima de restricción + + R mezclado Transformar bacterias ligasa

  13. X DNA NO se replica Ori-coli R Medio con antibiótico Se replica

  14. Metodo de footprinting para determinar el sitio de origen de la replicación

  15. Dna A reconoce el sitio de inicio de la replicación • Nucleasa + DNA Ori • Dna A + DNA Ori • DnaB + DNA Ori • DnaC + DNA Ori 1 2 3 4 245 1

  16. Secuencia del origen de Replicación bacteriano 5 Nonámeros o cajas DnaA Región de los treceámeros (tres repeticiones de 13 nucleótidos), 70% AT once sitios GATC en la secuencia de 245pb

  17. Organización del OriC DUE: DNA unwinding element IHF: Integration host factor FIS factor R1=R4>R2>R3=R5

  18. DnaA

  19. DiaA: DnaA initiator-associating protein IHF: Integration Host factor • Activación 20-30 • DnaA

  20. Arginina 285 es importante en la oligomerización

  21. Proteína DnaA • Monómero 52kDa • Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas dnaA • Estequiometria de hasta 20-30 subunidades de DnaA por oriC • Une ATP y lo hidroliza a una velocidad muy baja • Una vez abiertos los treceámeros, DnaA reconoce las cajas presentes en el DUE y se une a la cadena sencilla estabilizandola.

  22. Regulación negativa del inicio de la replicación

  23. 1) Hda (RIDA: regulatory inactivation of DnaA)

  24. 2) dat locus (DnaA titulación): sitio en el cromosoma que une grandes cantidades de proteína DnaA Aproximadamente 200-300 moléculas de DnaA pueden unirse al locus dat. El locus dat (1kb) contiene 5 cajas DnaA y un sitio para IHF DDAH: dat dependent DnaA-ATP hydrolisis

  25. 3) Interacción de OriC con SeqA y la membrana

  26. Regulacion de la expresión de DnaA Promotor de DnaA tiene cajas DnaA y secuencias GATC. Regulación de DnaA

  27. Reactivación de DnaA-ADP a DnaA-ATP DARS: DnaA reactivation sequence: sitios en el cromosoma que contienen cajas DnaA en orientaciones diferentes

  28. DiaA: DnaA initiator-associating protein IHF: Integration Host factor • Activación 20-30 • DnaA 2. Formación del pre-primosoma

  29. HELICASA DnaB C-terminal ATPasa Se mueve en dirección 5´---3´

  30. DnaB Dna C • Monómeros de 28 kDa • Homohexámero que permite la llegada de DnaB • ATPasa: al hidrolizar ATP pierde afinidad por DnaB • Monómeros de 60kDa que forman un homohexámero • Actividad de helicasa • Dominios para : • Unión a DNA de cadena doble • Unión a DNA cadena sencilla • Interacción con DnaC y DnaA • Hidrólisis de NTPs (ATP)

  31. Pre-primosoma y primosoma

  32. II. Elongación

  33. La replicación del DNA requiere un cebador catalizado por la DNA Primasa • Dna G, Primasa, ≈ 60 kDa • RNA polimerasa • Sintetiza cebador de ≈ 12nt • DNA Primasa reconoce a DnaB

  34. Proteínas de unión a cadena sencilla: SSB Las proteínas SSB se unen con alta afinidad al DNA de cadena sencilla y lo protegen de nucleasas y de asociaciones intracatenarias

  35. DNA polimerasas de bacterias

  36. Reacción de polimerización

  37. DNA polimerasas en E. coli

  38. Características de la DNA polimerasa I

  39. Actividades de la DNA polimerasa I

  40. Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son “viables”, por lo tanto la DNA polI no es la principal enzima replicativa (pero no soportan deleciones del gen). • Mutantes de DNA pol II son viables, aún con el gen deletado. • La DNApolIII es la principal enzima en la replicación del DNA. Las mutaciones son letales.

  41. Fidelidadse refiere al seguimiento exacto de la secuencia de DNA que sirve como molde • La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10-8 a 10-10 • Procesividad# de nucleótidos que se sintetizan en un solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega miles.

  42. Por qué no existe una DNA polimerasa 3´--5´?

  43. DNA polimerasa III holoenzima an asymmetric dimer

  44. Subunidades de la DNA polimerasa III de E.coli Pol III Núcleo 10-15 nuc/seg Pol III’ Abrazadera que carga las subunidades β al DNA Complejo  ó complejo  Pol III* Pol III holo 1,000 bases/seg

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