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第十二章　固相膜免疫测定

第十二. 第十二章　固相膜免疫测定. 第一节 概述 一、免疫测定分类 二、免疫测定原理 三、固相免疫测定 四、固相膜的特点 五、常用的固相膜 六、固相膜的技术要求. 第二节 免疫金标记技术 一、胶体金的制备 第三节 膜载体免疫测定的种类与原理 一、膜固相免疫测定的特点 二、固相微孔膜测定种类 三、免疫渗滤试验和免疫层析试验 四、酶联免疫斑点试验 五、免疫印迹 六、放射免疫沉淀试验. 思考题 小结.

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第十二章　固相膜免疫测定

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  1. 第十二 第十二章　固相膜免疫测定 第一节 概述 一、免疫测定分类 二、免疫测定原理 三、固相免疫测定 四、固相膜的特点 五、常用的固相膜 六、固相膜的技术要求

  2. 第二节 免疫金标记技术 一、胶体金的制备 第三节 膜载体免疫测定的种类与原理 一、膜固相免疫测定的特点 二、固相微孔膜测定种类 三、免疫渗滤试验和免疫层析试验 四、酶联免疫斑点试验 五、免疫印迹 六、放射免疫沉淀试验 思考题 小结

  3. 随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。

  4. 第一节 概述 标记免疫测定 放射免疫测定 　 1960’ 酶免疫测定 　　 1970’ 荧光免疫测定 1980’－1990’ 化学发光免疫测定 1990’－ 膜固相免疫测定 1990’－

  5. 一、免疫测定分类 免疫浊度测定 Ag + Ab AgAb + Ab 标记免疫测定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （B） （F）

  6. 二、免疫测定原理 利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 　抗原+抗体 抗原抗体复合物 Ag +Ab Ag * Ab

  7. 三、固相免疫测定 B与F分离 Ab* Ab* Ag + Ag + Ab* Ab Ab

  8. 四、固相膜的特点 • 多孔性毛细管作用 • 非共价键高度吸附抗体或抗原高度敏感性 • 易于漂洗操作简便

  9. 五、常用的固相膜 玻璃纤维素(fiberglass)膜 尼龙(nylon)膜 聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜 硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜

  10. 六、固相膜的技术要求 • 孔径：0.2~0.6 μm • 流速：以ml/cm2/min表示 • 蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 • 均一性

  11. 固相NC膜

  12. 第二节　免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。

  13. 一、胶体金制备 胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。

  14. 胶体金的制备及特性 *还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量

  15. 胶 体 金（Colloidal Gold）15~60 nm 优 质 劣 质

  16. 胶体金结合物（Conjugate）

  17. 第三节　膜载体免疫测定的种类与原理 膜固相免疫测定的特点

  18. 固相微孔膜测定种类 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA） 斑点ELISA(dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)

  19. 一、免疫渗滤测定(IFA)

  20. A B IFA——双抗体夹心法测抗原

  21. IFA——结果判断

  22. 二、免疫层析测定（ ICA ）

  23. ICA 试剂条 结 合 物 垫 样 品 垫 吸 水 垫 NC 膜

  24. ICA——双抗体夹心法测抗原

  25. ICA——间接法测抗体

  26. ICA 结果观察 阳性 阴性 无效

  27. IFA与ICA的比较

  28. IFA 穿流（FLOW THROUGH） ICA 横流（LATERAL FLOW）

  29. 阳性 阴性 固相膜 固相抗原 待测抗体 人IgG 固相抗人IgG抗体 金标记抗人IgG抗体 快速检测（渗滤法）原理图 GIFA技术的发展（间接法测抗体）

  30. GIFA技术的发展

  31. ICA技术的发展 1990年 ABBOTT公司 胶体硒标记ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.1~3 ng/ml 合成TnT质控点

  32. 半定量测定 测 定 线 对 照 线 T C2 C1 S C

  33. 三、斑点酶免疫吸附试验 ——Dot-ELISA

  34. 四、酶联免疫斑点试验——ELISPOT • 20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT)。

  35. ELISPOT 检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL 公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

  36. ELISPOT 分析仪解决以下问题 • 哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值） • 斑点大小的意义 • 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸 • 如何从单个细胞基础上分析 • 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？ • 几次重复实验才能使结果更有意义？

  37. ELISAPOT

  38. ELISPOT结果判断

  39. 方法学评价

  40. 五、免疫印迹法——Westernblot法 原理 Westernblot——抗原表位可能被破坏而漏检

  41. 六、放射免疫沉淀试验 原理 放射免疫沉淀试验——抗原表位不会破坏

  42. 思考题 1. 叙述固相膜免疫测定概念。 2．膜的种类与特性是什么？ 3．膜载体免疫测定的种类有哪些？ 4．斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)的原理是什么？ 5．免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）的原理是什么？

  43. 6．斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 原理是什么？ 7．酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 原理是什么？ 8．免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 原理是什么？ 9．免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 注意事项是什么？ 10．放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 原理是什么？

  44. 小 结 固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析试验、斑点ELISA 、酶联免疫斑点试验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。

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