1 / 65

Translasjon

Translasjon. Proteinsyntese. Winnie Eskild, IMBV 2004. Translasjon. Translasjon er den prosessen hvor mRNA’s nukleotidsekvens oversettes til aminosyresekvensen i et protein Translasjon foregår i cytosol Vår forståelse av denne prosessen er basert på tre viktige oppdagelser

dionne
Download Presentation

Translasjon

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Translasjon Proteinsyntese Winnie Eskild, IMBV 2004

  2. Translasjon • Translasjon er den prosessen hvor mRNA’s nukleotidsekvens oversettes til aminosyresekvensen i et protein • Translasjon foregår i cytosol • Vår forståelse av denne prosessen er basert på tre viktige oppdagelser 1) Ribosomene er proteinfabrikker 2) Aminosyrene aktiveres før de koples sammen til proteiner 3) tRNA oversetter nukleotidsekvensen i mRNA til aminosyresekvensen i et protein

  3. Ribosomene er proteinfabrikker • Injeksjon av radioaktive aminosyrer • Isolasjon av forskjellige organeller ved hjelp av subcellulær fraksjonering • Ribosomene var de første organellene som ble radioaktivt merket

  4. Aminosyrene aktiveres for proteinsyntese • Aminosyrer ble inkubert med cytosolisk fraksjon fra leverceller og ATP • Analyse viste aminosyrer bundet til et varmestabilt løselig RNA-molekyle • Komplekset kalles aminoacyl-tRNA • RNA-molekylet kalles tRNA = transfer RNA

  5. Aminosyrene aktiveres for proteinsyntese • Enzymet aminoacyl-tRNA syntetase kopler aminosyre og tRNA sammen • Hver aminosyre har sin egen aminoacyl-tRNA syntetase og en eller flere spesifikke tRNA • Disse navngis etter den aminosyre de binder f.eks aminoacyl-tRNAGly og tRNAGly

  6. tRNA oversetter nukleotidsekvensen til en aminosyresekvens • tRNA oversetter tre nukleotider til en aminosyre • Nukleotidspråket har fire bokstaver og leses som ord bestående av tre bokstaver • Dette gir mulighet for 43 forskjellige ord, kodons, dvs 64 • Kodons kalles også tripletter • 61 kodons spesifiserer aminosyrer • 3 kodons er stoppkodons og signaliserer avslutning av translasjonen

  7. Den genetiske koden • I én sammenhengende sekvens foreligger triplettene uten mellomrom, overlapp eller tegnsetting 5’-UUGGCAGCAAUGGUCGGAUAGCGACAGUCUAGC------3’ AUGGUCGGAUAGCGACAGUCUAGC------3’ UGGUCGGAUAGCGACAGUCUAGC-------3’ GGUCGGAUAGCGACAGUCUAGC-------3’ • Enhver nukleotidsekvens har tre teoretiske leserammer som er helt forskjellige • Med få unntak koder bare én leseramme for funksjonelt protein • Første kodon definerer leserammen og dermed aminosyresekvensen • Første kodon er alltid metionin

  8. Innskudd og delesjoner ødelegger leserammen

  9. Desiffrering av den genetiske koden • 61 av de 64 mulige tripletter koder for aminosyrer • Hvilke tripletter koder for hvilke aminosyrer? • Syntetiske polynukleotider med definert nukletidsekvens avslørte det • Poly(U) inkubert med radioaktive aminosyrer ga polyfenylalanin • Poly(C) inkubert med radioaktive aminosyrer ga polyprolin • Poly(A) inkubert med radioaktive aminosyrer ga polylysin

  10. Desiffrering av den genetiske koden • Inkubasjon av polynukleotid fosforylase med nukleotid-difosfater i forskjellige forhold ga polynukleotider som avspeilet nukleotidforholdet f.eks ADP og CDP i forholdet 5:1 vil gi - mange tripletter av typen AAA - noe færre tripletter av typen AAC, ACA, CAA - nokså få tripletter av typen ACC, CCA, CAC - Svært få tripletter av typen CCC • Eksperimenter med mange slike syntetiske polynukleotider dannet utfra forskjellige blandinger av nukleotider førte til avsløring av den genetiske koden

  11. Kodons med spesielle funksjoner • AUG er initieringskodon for translasjon • Alle proteinsynteser starter med metionin • AUG koder også for metionin andre steder i proteinet • UAA, UAG og UGA er termineringskodons. Disse koder ikke for noen aminosyre og fører til avslutning av translasjonen

  12. Åpen leseramme • I en vilkårlig nukleotidsekvens finner man en termineringskodon for hver 20 tripletter uansett leseramme • En åpen leseramme defineres som en nukleotidsekvens hvor det ikke forekommer termineringskodons før etter 50 tripletter eller mere • Lange åpne leserammer er oftest proteinkodende sekvenser • Et protein på ca 60 kDa vil kreve en åpen leseramme på 1640 nukleotider eller mere

  13. Den genetiske koden er degenerert • Degenerert betyr at flere kodons koder for samme aminosyre • Degenerert betyr ikke unøyaktig for ingen kodon koder for mere enn en aminosyre • Noen aminosyrer har bare en kodon: Met, Trp • Mange aminosyrer har to kodons: Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Lys, Phe, Tyr • En aminosyre har tre kodons: Ile • Noen aminosyrer har fire kodons: Ala, Gly, Pro, Thr, Val • Tre aminosyrer har seks kodons: Arg, Leu, Ser

  14. Degenererte kodons • Når flere kodons koder for samme aminosyre ser en ofte at de to første nukleotidene i kodonene er konstante og bare tredje nukleotid varierer • For aminosyrer med mere enn seks kodons vil selvsagt også andre nukleotider variere • Årsaken til at variasjon i tredje nukleotid tillates ligger hos tRNA og forklares med Wobble hypotesen

  15. tRNAs antikodon • tRNA avleser kodon på mRNA ved å basepare til den med sin antikodon • Antikodon er komplementær til kodon • De finnes minst én tRNA for hver aminosyre, men det finnes ikke én tRNA for hver kodon • En gitt tRNA kan altså basepares til flere enn én kodon

  16. tRNAs antikodon • Mange tRNA antikodons inneholder inosin i posisjon 1 • Inosin kan basepare med A, U eller C • En antikodon med I i posisjon 1 kan altså basepare til tre forskjellige kodons, forutsatt de to andre posisjoner holdes konstante

  17. tRNA kan kjenne igjen inntil 3 kodons • Baseparing mellom kodon og antikodon er antiparallel • Inosin baseparer til A, U og C med svake hydrogenbindinger • Inosin kan bare sitte i antikodonposisjon nr 1 • Inosin tillater bare variasjon i posisjon nr 3 i kodon

  18. Inosinat

  19. Wobble hypotesen 1) De første to basene i en kodon vil alltid danne sterke hydrogenbindinger til antikodon og utgjør basis for mesteparten av spesifisiteten

  20. Wobble hypotesen 2) Lest fra 5’-siden vil den første basen i antikodon være bestemmende for hvor mange kodon pågjeldende tRNA kan kjenne igjen - er den første basen en C eller en A, så er baseparringen meget spesifikk og tRNA kjenner bare igjen én kodon - er den første basen en U eller en G, så er baseparringen mindre spesifikk og tRNA vil kjenne igjen to kodons - er den første base en I (Wobble), så er baseparringen svak og tRNA kan kjenne igjen tre kodons - Tre kodons er det maksimale en tRNA kan kjenne igjen

  21. Wobble hypotesen 3) Hvis en aminosyre har mere enn en kodon så må de kodons som er forskjellige i de to første basene, ha forskjellige tRNA - Eks: leucin har fire kodons: UUA, UUG, CUA, CUG

  22. Wobble hypotesen 4) Det trengs minumum 32 forskjellige tRNA for å oversette de 61 aminosyre kodons

  23. Hvorfor Wobble? • Den tredje basen i kodon (Wobble basen)baseparer svakere enn de to andre basene men bidrar til spesifisitet likevel • Den svakere baseparingen tillater raskere dissosiasjon fra antikodon • Ved full baseparing for alle tre baser vil dissosiasjonen ta for lang tid og dermed redusere hastigheten av translasjonen • Wobble er uttrykk for et kompromis som sikrer tilstrekkelig spesifisitet samtidig som det tillater høy hastighet

  24. Overlappende gener • Enhver gensekvens har tre mulige leserammer men det er sjelden at mere enn én er i bruk • Generelt gjelder det at én leseramme koder for ét protein eller RNA • Hos virus ser en unntak fra denne regel • Overlappende leserammer begrenser i stor grad hvilken aminosyresekvens som er mulig i det overlappende genet

  25. fX174 • Analyse av den totale aminosyresekvens i fX174 viste at genomet ikke var stort nok til å kode for alt dersom det bare ble brukt én leseramme • Her finnes overlappende gener og gener i gener • En fordel for virus som må pakke sitt genom på svært begrenset plass i virus kapslen

  26. Den genetiske koden er universell • Generelt gjelder at den genetiske koden er universell • Det betyr at alle levende organismer benytter de samme kodons til å definere proteiners aminosyrer og at de bruker de samme aminosyrene • Det betyr at forskjellige organismer kan lese, transkribere og translatere gener fra hverandre. F.eks kan fisk uttrykke gener fra jordbær og blomster kan uttrykke gener fra fugler • Alle hovedregler har unntak og det gjelder også denne • Mitokondrier har en noe avvikende bruk av kodons, hvor en stoppkodon benyttes som kodon for Trp, mens en kodon for Arg benyttes som stoppkodon. Den vanlige kodon for Ile koder for Met i mitokondriene • Liknende avvik finnes hos en del mikroorganismer og andre arter

  27. Ribosomet • Bakterier inneholder ca 20000 ribosomer/celle • Består av en stor (50S) og en liten subenhet (30S). Hele ribosomet er 70S • Subenhetenes form passer inn i hverandre og danner en kløft mellom seg hvor mRNA passerer

  28. Ribosomet • 50S består av 23S rRNA, 5S rRNA og 36 proteiner • 30S består av 16S rRNA og 21 proteiner • Ribosomale proteiner varierer fra 6-75 kDa og er enzymer eller strukturelle komponenter • rRNA danner et rammeverk hvor proteinene festes men fungerer også som ribozymer • Eukaryote ribosomer er større og mere komplekse

  29. tRNA • tRNA er små molekyler, 73-93 nukleotider • Mange modifiserte baser • Mye intramolekylær hydrogenbinding danner en kløverbladstruktur med 4 armer

  30. tRNA • Aminosyrearmen bærer aminosyren bundet med esterbinding til 2’- eller 3’-C-atomet i 3’-enden av adenosin. Ulik lengde på 3’- og 5’-endene • 3’-enden slutter alltid med purin-C-C-A • 5’-enden har nesten alltid terminal guanosin • D-armen inneholder dihydrouridin • Antikodonarmen inneholder antikodon og har 7 ikke-baseparrete nukleotider • Ekstraarmen har varierende størrelse • TyC-armen inneholder uvanlige baser • TyC- og D-armen viktige for folding av tRNA

  31. tRNA 3D-struktur

  32. Translasjon Translasjon er en prosess som består av mange trinn: 1) Aktivering av aminosyrer Her koples tRNA sammen med sin spesifikke aminosyre Hver aminosyre har en eller flere tRNA. Disse benevnes etter hvilken aminosyre de bærer f.eks tRNAGly Sammenkoplingen katalyseres av aminoacyl-tRNA syntetaser Hver aminosyre har én aminoacyl-tRNA syntetase. Benevnes etter hvilken tRNA og aminosyre de sammenkopler f.eks Gly-tRNAGly syntetase 2) Initiering av translasjon mRNA bindes til ribosomets 30S subenhet Det translasjonsinitierende aminoacyl-tRNA kompleks bindes Ribosomets store subenhet, 50S, bindes

  33. Translasjon 3) Elongering av polypeptidet Kodonspesifiserte aminoacyl-tRNA komplekser bindes til mRNA på ribosomet Aminosyrene koples sammen med peptidbindinger 4) Terminering av translasjonen Når mRNA er avlest frem til en stoppkodon avsluttes translasjonen 5) Posttranslasjonell prossesering og folding av proteinet En eller flere aminosyrer fjernes fra aminoterminalen Aminosyrer modifiseres på forskjellig vis: fosforyleringacetylering, metylering, karboksylering Oligosakkarider eller andre prostetiske grupper koples på Proteinet foldes til korrekt konformasjon

  34. Aktivering av aminosyren • Foregår i cytosol • Aminosyren koples til sin spesifikke tRNA av aminoacyl-tRNA syntetase • Hvis en aminosyre har flere tRNA kan enzymet gjenkjenne alle

  35. Aktivering av aminosyrer - 1.trinn En anhydridbinding dannes mellom aminosyrens karbok- sylgruppe og a-fosfaten i ATP. PPi spaltes fra. Denne spaltes til 2 Pi

  36. Aktivering av aminosyrer - 2. trinn • Aminoacylgruppen flyttes til tRNA. Avhengig av enzym-type koples aminoacyl til 2’- eller 3’-C-atomet i adenosin. • Klasse II enzymer kopler direkte til 3’-C • Klasse I enzymer kopler til 2’-C og deretter overføres aminoacylgruppen til 3’-C i en trans-esterifiseringsreaksjon

  37. Aktivering av aminosyrer • Nettoreaksjon: aminosyre + tRNA + ATP Mg 2+ aminoacyl-tRNA + AMP + 2Pi • To anhydridbindinger er spaltet og vi har fått dannet en esterbinding • Enzymer: aminoacyl-tRNA syntetase + pyrofosfatase • DG’o = -29 kJ/mol

  38. Korrekturlesing • Aminoacyl-tRNA syntetasene binder de aminosyrer de kopler til sin tRNA i spesifikke bindingsseter • Noen aminosyrer er så like at de må korrekturleses for å sikre at rett aminosyre er koplet til sin tRNA • F.eks er sidekjeden til valin litt mindre enn sidekjeden til isoleucin og ellers svært lik • Derfor har Ile-tRNAIle syntetase et korrekturlesingssete. • Korrekturlesingssetet sjekker allerede på 1. trinn dvs aktiveringen av aminosyren. Hvis feil aminosyre har blitt aktivert av Ile-tRNAIle syntetase hydrolyseres Val-AMP til valin og AMP. • Korrekturlesing utføres også i det setet som kopler aminosyren på tRNAen sin • Feilinnkorporering av aminosyrer i proteiner forekommer én gang for hver ca 10000 aminosyre. Slike proteiner degraderes

  39. Korrekturlesing • Aminoacyl-tRNA syntetasene må også være spesifikke for tRNA • Det er spesielt aminoarmen og antikodonarmen i tRNA som spesifikt gjenkjennes av enzymene • Spesifisiteten i aminoacyl-tRNA syntetase reaksjonen omtales gjerne som genetisk kode nr 2

  40. Initiering av translasjon • Syntese av proteiner starter med aminoterminalen • Innmerking av hemoglobin i røde blodceller demonstrerte dette • Radioaktiv leucin ble tilsatt og hemoglobin isolert etter forskjellige tidsrom • Kortest inkuberingstid ga liten innmerking i C-terminalt område • Jo lenger innmerkingstid jo nærmere N-terminalen ble det registrert radioaktiv merking

  41. Formylmetionin • Alle proteiner starter med metionin • Metionin har bare én kodon så hvordan skjelne mellom metionin i starten av et protein og metionin inni polypeptidkjeden • Alle organismer har to tRNA for metionin, én for start metionin og en for alle andre • I bakterier har man tRNAMet og tRNAfMet • Den første metionin er formylert: N-formylmetionin, fMet H COO- H-C-N-C-H O CH2 CH2 S CH3

  42. Formylmetionin • Metionin får overført en formylgruppe fra N10-formyltetrahydrofolat i en totrinnsprosess: Metionin + tRNAfMet + ATP Met-tRNAfMet + AMP + PPi N10-formyltetrahydrofolat + Met-tRNAfMet tetrahydrofolat + fMet-tRNAfMet Enzymet er transformylase som er spesifikk for Met-tRNAfMet fMet-tRNAfMet kan bare bindes til den initierende AUG • Ved aktivering av aminosyrer i cytosol hos eukaryoter brukes ikke formylering på den første Met men det finnes en spesiell tRNA • Aktivering av aminosyrer i mitokondrier og kloroplaster hos eukaryoter benytter formylering

  43. Shine-Delgarno sekvensen • I bakteriell mRNA definerer Shine-Delgarno sekvensen translasjonsstart • SD-sekvensen festes til 30S subenheten av ribosomer • Består av 4-9 puriner (A,G) 8-13 baser 5’ for AUG

  44. Translasjonsinitiering • Ribosomet har tre seter: • Aminoacylsetet, A-setet • Peptidylsetet, P-setet • Exitsetet, E-setet • Initiering krever: • 30S subenheten av ribosomet • mRNA • fMet-tRNAfMet • Initieringsfaktorene: IF-1, IF-2, IF-3 • GTP • 50S subenheten av ribosomet • Mg 2+

  45. Translasjonsinitiering • Først bindes IF-1 og IF-3 til 30S subenheten • IF-3 hindrer at 50S subenheten binder seg til 30S subenheten inntil videre • IF-1 hindrer at det første aminoacyl kompleks, fMet-tRNAfMet, binder seg til A-setet • mRNA bindes slik at initierings-kodon sitter rett ut for P-setet. Det er binding av Shine-Delgarno sekvensen til en komplementær sekvens på 16S rRNA i 30S som posisjonerer mRNA

More Related