Enzymtechnologie und Biokatalyse

1. Enzymtechnologie und Biokatalyse Bernd Nidetzky Institut für Biotechnologie und Bioprozesstechnik • Inhalt • Industrielle Biotransformationen • Enzymtechnologie

2. Why use enzymes? ‡ The lower the Gibbs free energy of ‡,the higher is the reaction rate. Gibbs free energy A + E B Reaction coordinate (= progress of reaction) • Rate accelerations in enzymic reaction are typically 1010-fold or greater, compared to the same uncatalyzed reaction. • This is achieved through a selective stabilisation of the transition state of reaction (‡). • The thermodynamic equilibrium constant (= [B] / [A]) is, of course, not altered.

3. Nature (1991) 350, 121.

4. Technical factors favouring the use of enzymes • Reactions possible that are not possible using chemistry • high-fructose corn syrup • L-tert-leucine (chiral intermediate) • Specificity of reaction • substrate specificity (Aspartame) • positional specificity (S-2-chloropropanoic acid) • stereospecificity (non-proteionogenic amino acids) • Milder reaction conditions and elimination of organic solvents from processing • 6-amino-penicillanic acid (downstream processing simpler) • polysaccharide hydrolysis (avoidance of by-products; improved yield) • Reduction in the number of process steps • Tools to improve the catalyst by genetic engineering Question: How can genetic engineering assist in enzyme improvement?

5. Common prejudices against the use of enzymes Bulk prices in k$ per kg of product ENZYMES • Lactic dehydrogenase (100) • Penicillin amidase (10) • Trypsin (5) • Lipase (5) • Glucose isomerase (0.5) • Detergent protease (0.25) • Glucoamylase (0.1) METAL CATALYSTS • BINAP (40) • Platinum (12) • Sharpless (10) • Jacobsen (1) • Raney nickel (0.03) from: Rozzell J.D. (1999) Bioorg.Med.Chem. 7, 2253 Prejudice 1: ... that enzymes are too expensive catalysts.

6. Prejudice 2: ... that enzymes are intrinsically too unstable to be used in an industrial process. from: Rozzell J.D. (1999) Bioorg.Med.Chem. 7, 2253

7. Prejudice 3: ... that expensive co-substrates cannot be recycled efficiently such that their costs do not make a large contribution to the total product costs. Questions: What are advantages and disadvantages of using a PEG-derivative of NAD(H)? What are advantages of the reaction catalyzed by formate dehydrogenase?

8. Enzymes of all primary EC classes have become relevant industrially ... EC classes (http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/) ... although the EC 3, the hydrolases, clearly predominate. Questions: What are examples of reactions catalyzed by enzymes of EC 1 - 6? What are potential uses of the reactions in biotechnology? Why are hydrolases used most often?

9. Example: EC 3 The hydrolases Question: Find examples of substrates that are hydrolyzed enzymatically?

10. Industrielle Biotransformationen • Begriffsdefinitionen (Bommarius AS, Riebel B. 2004. Biocatalysis. Wiley-VCH • Biotransformationen setzen definierte Edukte (“precursors”) in einer Serie von definierten (allerdings nicht immer genau bekannten) Schritten mit Enzymen oder ruhenden Zellen in ein gewünschtes (und definiertes) Produkt um. • Fermentationen transformieren Rohmaterialien wie Zucker, Stärke, Methanol (u.ä.) oder industrielle Mischsubstrate wie Melasse mittels lebender Zellen in ein gewünschtes, zum Teil komplexes Produkt. Anmerkung: Häufig handelt es sich dabei um Produkte des Primär- oder Sekundärmetabolismus • Edukt Fermentationen (“precursor fermentations”) starten mit definierten Edukten und transformieren sie mit lebenden Zellen in das gewünschte Produkt. Anmerkung: Viele biologische Redoxtransformationen fallen in diesen Bereich. • Enzymtechnologische Prozesse fallen häufig in den Bereich der Biotransformationen und Edukt Fermentationen. Weiters werden Enzyme in der Biotechnologie als Prozesshilfsmittel, in der Analytik und als Therapeutika eingesetzt.

11. Biotransformationen • eröffnen teilweise völlig neue technologische Optionen (“enabling technologies”), oder • befinden sich in direkter Konkurrenz mit chemisch-katalysierten Reaktionen. • Im Bereich Pharmazie ist die enantiomere Reinheit neuer Wirkstoffe von herausragender Bedeutung, und Biotransformationen zeigen zumeist die besten Resultate. • Etwa 134 industrielle Biotransformationen im Maßstab von mehr als 100 kg sind beschrieben, bei denen ganze Zellen oder Enzyme als Katalysatoren für die Transformationen von Substraten eingesetzt werden, die nicht als C-Quellen verwendet werden. Davon basieren: • 44% auf Hydrolasen, und • 30% auf Oxidoreduktasen. • Im Bereich Feinchemikaliensynthese (nicht Pharma-Anwendung) sind 78% Ausbeute, 108 g/L Produktkonzentration, und eine volumetrische Produktivität von 372 g / (L d) typisch.

12. Biotransformationen • haben viele Vorteile, (Wiederholen Sie diese!) • einige vorurteilsbehaftete Nachteile, wie • limitierte Anzahl von nützlichen Enzymen (teilweise) • limitierte Verfügbarkeit (nein) • limitiertes Substratspektrum (teilweise) • mangelnde Stabilität (teilweise) • grundsätzlich niedrige Raum-Zeit-Ausbeuten (nein) • Bedarf an teuren Kosubstraten (teilweise, prozessbedingt) • Kosten (chemische Katalysatoren sind nicht billig!) • erkannte Probleme von Biotransformationen bleiben: • Stabilität, vor allem in nicht konventionellen Medien • Anzahl der Biokatalysatoren (etwa 4000 bekannte; 2004) für benötigte Transformationen • Zeitdauer für die Entwicklung zu hoch • Entwicklungspotenzial für die Zukunft • ökonomische Rahmenbedingungen und Konkurrenz in der chemischen Industrie, und • chemische Prozesse innerhalb gesellschaftlicher Rahmenbedingungen, die saubere (oder weniger verschmutzte) Umwelt betonen.

13. Wirtschaftliches Potenzial • Globaler Enzymmarkt etwa 2 Milliarden Euro pro Jahr • Enzyme im Lebensmittelbereich (600 Mio. Euro pro Jahr) • Futtermittelenzyme (200 Mio. Euro pro Jahr) • Enzyme als Biokatalysatoren (Waschmittelsektor, Feinchemikalien, ...; 1000 Mio. Euro pro Jahr) • Enzyme in der Analytik und in der Therapie (etwa ≤ 10% des gesamten Marktes) • Seit 1979 ist eine Steigerung der Angestellten im Bereich Enzymproduktion um das mehr als 10-fache zu beobachten. So gibt der weltgrößte Enzymproduzent Novozymes etwa 3000 Beschäftigte an; der geschätzte Wert weltweit liegt bei ungefähr 10000 Personen. Quelle: Buchholz et al. 2004. Biocatalysts and Enzyme Technology, Wiley-VCH • Weitere Daten: • 88% der biokatalytischen Prozesse im Maßstab über 100 kg haben chirale Zielprodukte • Von allen neuen Wirkstoffen in 2000 waren 78% enantiomerenrein, im Vergleich zu 1991 mit 21%. • Der Markt für enantiomerenreine Wirkstoffe (100 Milliarden Euro pro Jahr) ist etwa ein Fünftel des Gesamtmarktes und wächst mit etwa 15% pro Jahr etwa 2-mal so schnell wie der Gesamtmarkt.

14. Abbildung: Zusammenstellung von Biotransformationen auf Basis enzymtechnologischer Prozesse. Quelle: Buchholz et al. 2004. Biocatalysts and Enzyme Technology, Wiley-VCH Wiederholen Sie dazu die Klassifikation von Enzymen nach der EC Nomenklatur. Versuchen Sie einigen EC Nummern Reaktionen aus der organischen Chemie zuzuordnen, die Sie bereits kennengelernt haben. In der 3. Ausgabe der Enzyme Nomenclature in 1992 gab es 3196 Einträge. http://www.brenda.uni-koeln.de/ http://www.expasy.org/ http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ http://www.genome.ad.jp/kegg/ ligand.html http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/ cath_new

15. “Greener Chemistry” durch Biotransformationen • Beispiel der Konversion von Penicillin G bei Sandoz (Kundl) • Synthese von Ampicillin aus 6-APA Abbildung: Vergleich der chemischen und enzymatischen Prozesse für die Herstellung von 6-APA, welche als Intermediat für die Produktion von semi-synthetischen b-Lactam Antibiotika wie Ampicillin benötigt wird.

16. Weitere Vorteile durch Biotransformationen • Kostenreduktion • Ausbeutesteigerung (Penicillinhydrolyse) • Wiederverwertung durch Immobilisierung (Glucoseisomerisierung) • Bessere Rohstoffverwertung (Isomaltulose aus Saccharose) • Prozesskosten für Filtration (Saftherstellung), Energie (Niedertemperatur-Waschpulver), Käsereifung, Malzprozess bei der Bierherstellung • Verbesserung der Produktqualität • Enantiomerenreine Produkte • Technische Eigenschaften (transesterifizierte Fette, modifizierte Proteine, Biodiesel) • Geschmack (Proteine, Glucose-Fructose-Sirup) • Nutzung erneuerbarer Rohstoffe • Bioethanol • Molkeverwertung (Lactosespaltung) • Umweltfreundlichkeit • Molkeverwertung • Papierbleiche • Lederherstellung

17. Nachteile • Allergenizität durch Inhalation als kleine Partikel und von Proteinaerosolen, oder durch Kontakt mit der Haut • Lösung: Einkapselung in Partikel (dp ≥ 100 µm) mit wachsartiger Hülle • Wiederholen Sie andere mögliche Nachteile! • Fundamentale Parameter des Enzymeinsatzes • Beschleunigung der Reaktion kcat/kuncat ≤ 1.4 1017 • Katalytische Profizienz kcat/(kuncatKM) ≤ 1023 M-1 • Aktivität 1 Unit = 1 IU = 1 µmol min-1 • Spezifische Aktivität U (mg Protein)-1 • Volumetrische Aktivität U mL-1 • Umsatzfrequenz (1/kcat) s • Michaelis-Menten Parameter für 1 oder Mehrsubstratreaktionen • Stabilität (thermische Stabilität; während der Lagerung, während des Prozesses) • Selektivität (Stereo, Regio, Chemo; Stereoselektivität vieler Enzyme ist nicht perfekt) • Kriterien der Performance im Prozess

18. Scheme of biocatalytic process development Reaction engineering viewpoint Biotransformation characteristics Reaction medium Kinetic cons- traints Catalyst cons- traints Liquid flow pattern Mode of opera- tion Industrial enzyme reactor

19. Abbildung: Vergleich von thermodynamisch und kinetisch kontrollierten Reaktionen eines hydrolytischen Enzyms am Beispiel der Konversion von Lactose durch b-Galactosidase. Lactose ist ein Disaccharid, b1,4-D-Galactopyranosyl D-Glucopyranose. Unter thermodynamischer Kontrolle bildet das Enzym D-Gal und D-Glc, wobei Keq in 55 M Wasser weit auf der Seite der Produkte liegt. Unter kinetischer Kontrolle wird ein Trisaccharid gebildet, das wieder hydrolysiert wird. • Charakteristik der Reaktion • thermodynamisch kontrolliert (Keq ist der wesentliche Parameter, welcher von pH und T abhängig ist / sein kann) • kinetisch kontrolliert (Ausbeute ist Funktion der Reaktionszeit sowie der Eigenschaften des Katalysators, und möglicherweise von pH und T) Die kinetisch kontrollierte Synthese kann zur Bildung von Oligosacchariden (mit möglicher präbiotischer Wirkung) eingesetzt werden.

20. Einfluss von Reaktionsbedingungen auf Keq • Änderung der Enthalpie kann als Kriterium für den Einfluss der Temperatur auf Keq verwendet werden. • Hydrolyse von Penicillin G (20 kJ/mol; endotherm) liefert bei höheren Temperaturen bessere Produktausbeuten • Hydrolyse von Saccharose (-15 kJ/mol; exotherm) liefert bei höheren Temperaturen schlechtere Produktausbeuten • pH Einflüsse auf Keq können deutlich unterschiedlich sein zu pH Einflüssen auf die Enzymaktivität oder Enzymstabilität. • Manche Substrate können in unlöslicher Form verwendet werden, um damit die Produktkonzentration (in Lösung) in Gleichgewichts- aber vor allem auch in kinetisch kontrollierten Prozessen zu verbessern. Voraussetzung hierfür ist, dass der Massentransport Flüssig-Fest nicht limitierend für die Reaktionsrate ist. • Nicht natürliche Lösungsmittel (LM) können zugesetzt werden, wobei für hydrolytische Prozesse zu berücksichtigen ist, dass die Reduktion der Wasseraktivität zu einem aw-Wert signifikant kleiner als 1, sehr hohe LM-Konzentrationen erfordert; z.B. 50 Volumens % reichen keinesfalls aus! Die Stabilität und Aktivität vieler Enzyme ist in diesem Bereich nicht mehr garantiert.

21. Ionische Flüssigkeiten (IL) sind neue Alternativen zu bekannten organischen LM. Sie sind bei Reaktionstemperatur flüssige Salze. • Ein wichtiger Vorteil von IL ist ihre hohe Polarität. Einige Lipasen und Proteasen sind in nahezu wasserfreien IL aktiv, Glycosidasen nicht. • Generell gilt, dass Enzyme in völlig ‘trockenen’ LM nicht aktiv sind. • Konventionelle organische LM, die mit Enzymen kompatibel sind sind in der Regel sehr unpolar. Zur Darstellung der Polarität wird häufig der Parameter log P herangezogen, welcher im wesentlichen den Verteilungskoeffizienten zwischen Wasser und n-Oktanol darstellt. • Polare Lösungsmittel, z.B. Methanol, Ethanol, Aceton ... wirken oft denaturierend. Abbildung: Strukturen der am häufigsten verwendeten IL, 1-Butyl-3-Methylimidazolium Tetrafluoroborat (BMIM-BF4) sowie das Hexafluorophosphat (BMIM-PF6)

22. B A Abbildung:A. Schematische Darstellung einer Reaktion mit gering löslichem Substrat (AB) und Produkt (AN). Die Konzentrationen an der Grenzfläche (*) und in Lösung (l) sind gezeigt. B. Beispiel der Synthese von N-Acetyl-L-Tyr- L-Arg, einer Vorstufe von Kyotorphin (Tyr-Arg), mittels a-Chymotrypsin aus N-Acetyl-L-Tyr-OEt (ATEE) und L-Arg. Die gelöste Konzentration an ATEE war immer < 1 mM, während die Konzentration in Suspension bei 400 mM (weiße Kugelsymbole) und 800 mM (schwarze Kugelsymbole) lag. Die Quadrate zeigen die Konzentration des Hydrolyseproduktes N-Acetyl-L-Tyr. In Suspension wird der Massentransport (von Substrat) zwischen fester und flüssiger Phase wie folgt beschrieben: kL,SaS (S* - S) = (ShDS 3 a / 2 rS2) (S* - S) wobei kL,Sder Massentransfer-koeffizient ist,aSist die Oberfläche pro Volumenseinheit, Sh ist die Sherwood Zahl, DS ist der Diffusionskoeffizient, rSist der mittlere Radius des festen Substratpartikels, und a ist der Volumensanteil der Partikel in der Suspension. S*, Grenzflächenkonzentration.

23. Dazu eine Abschätzung für eine 10%-ige Suspension (a = 0.1) unter der Annahme eines Substrates mit MW = 500 (DS ≈ 5 x 10-6 cm2 s-1), Sh = 10, rS = 10-2 cm und (S* - S) = 1mM. • Die Rate der Lösung von S ergibt sich zu 75 x 10-6 M s-1, oder anders formuliert 4500 U l-1. Das eingesetzte Enzym sollte unter den Bedingungen (Achtung: S ≥ Km oder S ≤ Km!) eine signifikant höhere Aktivität aufweisen. • Sh = kL,Sdp / DS = gesamter Massentransfer / Massentransfer durch Diffusion • Für den Enzymeinsatz in nicht konventionellen Medien kannfolgende Klassifikation getroffen werden: • LM mit Wasser nicht mischbar (2-Phasensystem) • Enzym mit Wasser im organischen LM oder in IL suspendiert • Immobilisiertes Enzym im organischen LM oder in IL suspendiert • Puffer mit LM gesättigt • Puffer mit LM mischbar

24. Wie kann der Effekt des LM auf die Reaktion (Keq) abgeschätzt werden? • Für die Konversion von A und B in C gilt im 2-Phasensystem (KeqBi) im Vergleich zu wässriger Lösung (KeqAqu): • KeqBi = KeqAqu (1 + aPC) (1 + a) / [(1 + aPA) (1 + aPB)] wobei PA,B,C die Verteilungskoeffizienten für A, B und C sind. a ist das Volumensverhältnis von organischer und wässriger Phase. • Die Beziehung zeigt, dass höhere Ausbeuten an Produkt C dann erreicht werden können, wenn PC > PA ≈ PB, das heißt, wenn C hydrophober als A und B ist. • Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Aktivität • Temperatureinfluss wird meist durch die Arrhenius Beziehung akzeptabel beschrieben, soferne die Stabilität gegeben ist. Beachten Sie, dass nicht nur Vmax (oder kcat) sondern auch Km temperaturabhängig sein kann. Zumeist steigt Km mit steigender Temperatur, jedoch nicht so stark wie Vmax. • pH Einflüsse sind am besten in doppelt logarithmischen Diagrammen ersichtlich, also z.B. log Vmax gegen pH.

25. Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Aktivität • pH Effekte können die verschiedenen Enzymformen in Fließgleichgewicht (Steady State) unterschiedlich beeinflussen. Es ist daher nicht ungewöhnlich, wenn sich die pH-Profile von log Vmax (= Substratsättigung; Enzymform E-S), log Km (= Summe aller gebundenen Enzymformen, z.B. E-S und E-P) und log (Vmax / Km) (Enzymform E, da Substratkonzentration limitiert) deutlich voneinander unterscheiden. Zu beachten ist auch die Möglichkeit, dass das Substrat im relevanten pH-Bereich ionisiert, z.B. Aminosäuren. • Grundsätzlich wird man sich am pH-Profil für die Reaktion bei der technologisch relevanten Substratkonzentration orientieren. Überlegen Sie, wie pH-Profile aussehen können? Zeichnen Sie einige und begründen Sie für sich die Verläufe. • pH Effekte können reversible Protonierungs/Deprotonierungsreaktionen am Enzym (und Substrat) reflektieren, aber auch die pH-abhängige Denaturierung des Proteins wiederspiegeln!

26. Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Aktivität • Einfluss der IonenstärkeI (= 0.5 SCiZi2) wobei Ci die Ionenkonzentration von Ion i ist, und Zi ist seine Ionenladung. • Änderungen der Ionenstärke wirken sich auf die Aktivität von geladenen Substraten aus sowie auf die kinetischen Parameter des Enzyms, welches ein Polyion darstellt. • Für ZSZE > 0 nimmt kcat mit steigender Ionenstärke generell zu, für ZSZE < 0 ab. • Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Kinetik • Ausgehend von Michaelis-Menten Kinetik ist zu berücksichtigen, dass im Falle von frei reversiblen Reaktionen der Einfluss der Konversion von Produkt in Substrat, speziell bei höheren Substratumsätzen, wichtig wird. Kinetisch formuliert für eine 1-Substrat 1-Produkt Reaktion: • dS/dt = - [(VmaxS / KmS) S - (VmaxP / KmP) P] / [1 + (S / KmS) + (P / KmP )] • Weiters muss der Einfluss der Produktinhibierung berücksichtigt werden. Produkte sind meist kompetitive Inhibitoren gegen das strukturanaloge Substrat. Im Falle von Mehrsubstratreaktionen oder Reaktionen mit mehr als einem Produkt können Mischinhibierungen oder unkompetitive Inhibition auftreten (Vmax Effekt, der durch Substratsättigung nicht aufgehoben werden kann!!)

27. Abbildung: Bestimmung des Verhältnisses von Hydrolyse- zu Transferrate in einer kinetischen kontrollierten Reaktion der b-Galactosidase. Lactose (Gal-Glc) wird als Substrat verwendet. Im 1. Schritt wird die glykosidische Bindung gespalten, es bildet sich ein Intermediat aus Enzym und Gal (E-Gal) und Glc (vGlc) wird freigesetzt. E-Gal reagiert im 2. Schritt mit Wasser unter Bildung von Gal oder einem alternativen Akzeptor Nukleophil (Nu) unter Bildung eines neuen Galaktosids Gal-Nu. Je besser E-Gal mit Nu reagiert, umso größer wird das Verhältnis vGlc / vGal. • Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Kinetik - Selektivität • In kinetisch kontrollierten Reaktionen, z.B. die durch Hydrolasen katalysierte Synthese, ist das Verhältnis von Hydrolyserate (kwater) zu Transferrate (kNu) ausschlaggebend, wieviel Produkt gebildet werden kann. Hydrolytische Enzyme mit einem großem Ver-hältnis kNu / kwater eignen sich gut für die Synthese. Typisch sind Werte von 102 - 104 (M-1), im Vergleich zu 107 bis 108 für echte Transferasen.

28. Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Kinetik - Selektivität • Die Stereoselektivität eines Enzyms (Eeq) für die thermodynamisch kontrollierte Konversion eines racemischen Gemisches R und S kann wie folgt angegeben werden: • Eeq = [(Vmax / Km)S / (Vmax / Km)R] • Eine Alternative zur Bestimmung von Eeq ist die Ermittlung des enantiomeren Überschusses (eeS oder eeP) im Substrat oder Produkt nach erfolgter partieller Umsetzung: • eeP = |PS - PR| / (PS + PR) bzw. eeS = |SS - SR| / (SS + SR) • Der Umsatz (C) ist C = 1 - (SS + SR) / (SS,0 + SR,0) wobei der Index 0 die initiale Konzentration bezeichnet. • Weiters gilt, dass: • Eeq = ln [1 - C (1 + eeP)] / ln [1 - C (1 -eeP)] bzw. • Eeq = ln [1 - C (1 -eeS)] / ln [1 - C (1 +eeS)] Abbildung:Enatiomerer Überschüsse im Produkt (strichl. Linien) und Substrat (volle Linien) als Funktion des Reaktionsverlaufs für die Resolution eines Racemates mit einem (S)-spezifischen Enzym mit unterschiedlichen Eeq Werten. Für eeP ≥ 95 und Produktausbeuten ≥ 45% muss der Eeq Wert des Enzyms bei 100 oder darüber liegen.

29. Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Produktivität • Raum-Zeit Ausbeute (space time yield; STY) = (S0 - St) / Dt • STY ist zumeist durch ökonomische Überlegungen vorgegeben und determiniert unter anderem das Reaktorvolumen. • STY kann erhöht werden durch die Erhöhung der Substratkonzentration oder der Enzymaktivität durch Verwendung einer höheren Proteinkonzentration oder eines alternativen Enzyms mit größerer spezifischer Aktivität. • Weitere wichtige Parameter sind: • Umsatzzahl (Turnover Number; TON) = Mol Produkt / Mol Enzym • Produktivitätszahl (PN) = TON / Dt • Maximale Umsatzzahl (Total Turnover Number; TTN) = Mol Produkt / Mol verbrauchtes Enzym • Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Stabilität • Denaturierung (= Verlust der nativen Konformation) und Inaktivierung sind zumeist, aber nicht notwendigerweise gekoppelt. • Die Denaturierung kann erfolgen durch reversible und irreversible Entfaltung, Dissoziation von Untereinheiten in oligomeren Proteinen, Verlust von Kofaktoren, chemische Modifikation an Thiolen, Methioninen und Tryptophanen (Oxidation) sowie Lysinen (Reaktion mit reduzierenden Zuckern), und Hydrolyse von Peptidbindungen sowie Deamidierungsreaktionen.

30. Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Stabilität • Faktoren, die Inaktivierung hervorrufen, sind Temperatur, pH Wert, Scherkräfte, Kontakt mit Grenzflächen, Sauerstoff und Peroxide, hohe Konzentrationen eines reaktiven Substrates (z.B. Glucose), Verunreinigungen durch Metallionen, organische LM sowie Verunreinigungen durch Proteasen. • Immobilisierung und/oder Quervernetzung hat sich als Methode zur Stabilisierung gegen (partielle) Entfaltung bei ungünstigen Bedingungen (T, pH, organisches LM) und Betriebsparametern des Reaktors (Scherkräfte, Kontakt mit Grenzflächen) bewährt und ist billig. Chemisch bedingte Inaktivierung muss meist durch molekulare Modifikation (ortsgerichtete Mutagenese; gerichtete Evolution) verhindert werden. • Die Kinetik der Inaktivierung von Enzymen kann häufig mit sehr einfachen Modellen beschrieben werden. Für den Zweck der Stabilisierung sollte der konformationelle und chemische Mechanismus der Denaturierung / Inaktivierung bekannt sein, um gezielt stabilisieren zu können. Der Zusatz von z.B. b-Mercaptoethanol kann die Oxidation von Cys oder Met Resten verhindern bzw. verlangsamen. • Im Falle einer Inaktivierungskinetik 1. Ordnung (kin; s-1) kann das Verhältnis von kcat/ kin , welches groß sein soll, für die Enzymbewertung herangezogen werden.

31. Überlegungen zu den Katalysatoreigenschaften - Stabilität • Design des Mediums (oft empirisch / statistisch optimiert) • nach der Hofmeister Serie für Ionen • Al3+, Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, K+, NH4+, (CH3)4N+ • SCN-, I-, ClO4-, Br-, Cl-, HCOO-, CH3 COO-, SO42-, HPO42-, citrate3- • Von links nach rechts - steigend kosmotropischer Effekt (stabilisierend) • Von rechts nach links - steigend chaotroper Effekt (destabilisierend) • Aussalzen von Proteinen mit möglichst kosmotropen Salzen durchgeführt und häufig durch die Cohn Gleichung beschrieben: • log S = b - KsI wobei S die Löslichkeit des Proteins ist, b ist die Löslichkeit in salzfreier Lösung, Ks ist die Aussalzkonstante, und I ist die Ionenstärke. • Eine neue Strategie zur Gewinnung von Biokatalysatoren ist das Enzym während des Ausfällens Querzuvernetzen, z.B. mit Glutardialdehyd. Die Strategie führt zu Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs). • Weitere protektive Substanzen • b-Mercaptoethanol, Dithiothreitol • EDTA oder andere Chelatbildner • Polyethylenglykol, Glyzerin • Proteine (Rinderserumalbumin, Molkenproteine) • Liganden und Kofaktoren

32. Verbesserungen der Eigenschaften von technischen Enzymen (Bsp.) • a-Amylase • Ca2+-Abhängigkeit der Proteinstabilität durch rationales Proteindesign (ortsgerichtete multiple Mutagenese) eliminiert. • Glucoamylase • Temperaturstabilität durch Einbringen einer neuen S-S Brücke um 4 °C erhöht. • Glucose Isomerase • Inaktivierung in Gegenwart hoher Glucosekonzentrationen durch den Austausch von 3 Lysinen (gegen Arginin) an der Proteinoberfläche um den Faktor 3 reduziert. • Subtilisin (Waschmittelprotease) • Stabilität gegenüber Oxidationsmitteln durch den Ersatz eines Methionins gegen Serin um Faktor 100 verbessert. (Aktivität um Faktor 10 reduziert). • Thermische Stabilität durch 3 neue S-S Brücken um Faktor 100 verbessert. • Glutaryl Amidase, Penicillin Amidase • Verbesserung der Spezifitäten für die technologischen Substrate um etwa Faktor 6 • Verbesserung der pH Stabilität um den Faktor 3 • Verbesserung der Stereospezifität unter kinetisch kontrollierten Reaktionsbedingungen

33. Enzymgewinnung - Zellaufschluss • Chemische Methoden (Alkalibehandlung; organische LM wie Toluol; Detergenzien wie SDS, Triton X-100, oder Cetyl (C16) Trimethylammoniumbromid; Enzyme wie Lysozym; Lyse durch Phagen oder Antibiotika wie Penicillin oder Cephalosporin C) • Osmotischer Schock (Einfrieren, Auftauen) und Trocknung (Gefrier-, Sprüh-, Lösungsmittel) • Mechanische Verfahren • Scherkräfte in Lösung (Ultraschall, Rotor-Stator-Mischer - mechanische Rührung; Hochdruckhomogenisator - Druck; 1000 - 2000 bar) • Scherkräfte in Festsubstanz (Kugelmühle - Vermahlen; Mörser und Pistill - Vermahlen; X-Press - Druck) • Für den größeren Maßstab sind der Hochdruck-homogenisator und die Kugelmühle gut geeignet. • Kombinationen der Aufschlussmethoden sind möglich und sinnvoll.

34. Hochdruckhomogenisator • ist das meist verwendete Instrument in der Industrie und seit fast 100 Jahren im Einsatz. • Er wird bei Drücken von ≤ 160 MPa betrieben und besteht aus einer Hochdruckpumpe und einem einstellbaren Entspannungssventil. Die Zellsuspension wird durch das Ventil mit hoher Geschwindigkeit (etwa 350 m s-1) entspannt. Sowohl durch die Druckentspannung als auch durch das Auftreffen auf Prallringe werden hohe Scherkräfte erzeugt, die die Zellen aufbrechen. • Die Kinetik der Freisetzung von Enzymen aus der Zelle kann wie folgt beschrieben werden: • ln [Rm / (Rm-R)] = kNPawobei Rm die maximale Proteinmenge pro Masseneinheit Zellen ist (kg/kg), R ist die Masse an freigesetztem Protein zum Zeitpunkt t (kg/kg), k ist eine Geschwindigkeitskonstante 1. Ordnung (s-1), N sind die Anzahl der Passagen durch den Homogenisator, ist der Betriebsdruck, und a ist ein Exponent (typisch zwischen 1.86 und 2.9). • Eine Passage der Zellen bei 55 MPa führt in der Regel zu einer maximalen Proteinfreisetzung von 40%.

35. Abbildung:Schematische Darstellung des Hochdruckhomogenisators (eine technische Version davon ist der Gaulin Homogenisator) und der Kugelmühle. • Verschiedene Hochdruckhomogenisatoren unterscheiden sich neben dem maximalen Betriebsdruck vor allem in der Konstruk-tion des Entspannungsventils. Sie werden diskontinuierlich betrieben. • Kugelmühlen unterscheiden sich in der Konstruktion des Mahlwerks, im besonderen der Geometrie der Rührscheiben, und vor allem in den verwendeten Mahlkugeln (meist aus Glas): • für Hefe (0,75 - 1,0 mm) • für Bacillus sp. (0,50 - 0,75 mm) • für Brevibacterium sp. (0,25 - 0,50 mm). • Sie können kontinuierlich betrieben werden!

36. Typische Betriebsparameter einer Kugelmühle • Rührerspitzengeschwindigkeit: 10 - 15 m s-1 • Flussrate (Kammervolumen pro Stunde): ≈ 5 fach (Bakterien); ≈ 15 fach (Hefen) • Zelltrockenkonzentration: 10 - 15% • Beladung mit Kugeln: 85% (des Kammervolumens) • Kapazität: ≈ 4 kg Bakterien bzw. ≈ 10 kg Hefen pro Stunde und Liter Kammervolumen • Wichtig: Effektive Kühlung!! • Für die Zellsuspension sind folgende Parameter zu beachten und sind für die Prozessoptimierung relevant: physiologischer Zustand der Zelle (Wachstumsphase; Kultivierungsbedingungen; Lagerungsbedin-gungen); rheologische Eigenschaften der Suspension. • Die Kinetik der Produktfreisetzung kann angenähert nach folgender Beziehung beschrieben werden: • ln [Rm / (Rm-R)] = k t wobei die Geschwindigkeitskonstante k ein summarischer Parameter ist, in den die oben diskutierten Faktoren eingehen.

37. Der Mikrofluidizer stellt eine neue Entwicklung auf dem Gebiet dar. • Die Zellsuspension wird in einer Kammer geteilt und in Mikrokanälen von etwa 100 µm Durchmesser bei etwa 140 MPa geführt. • Die Flüssigkeitsströme prallen bei hoher Geschwindigkeit aufeinander und die Zellen werden durch kombinierte Effekte von Scherkräften, Turbulenz, und Kavitation (Implosion von Gasblasen auf Grund des Druckabfalls) aufgebrochen. • Die Verweilzeiten in der Kammer liegen bei einigen Hundertstel-sekunden. Mehrere Passagen (> 20) sind in der Regel nötig, um das Zellprotein zur Gänze freizusetzen. Abbildung: Darstellung eines Mikrofluidizers (links) mit der dazugehörigen Interaktions-kammer (oben), in der der Zellaufschluss passiert.

38. Enzymimmobilisierung • Gründe dafür: • Wiederverwendung des Enzyms, damit Optimierung von TON bzw. TTN sowie Reduktion des enzymspezifischen Kosten-anteils • Kontinuierliche Prozessführung mit teilweise vereinfachter Prozesskontrolle, optimierter Produktausbeute und kurzer Verweilzeit • Enzymstabilisierung • Einfache Produktseparation • Nachteile sind / können sein: • Trägerkosten, Immobilisierungskosten • Massentransportlimitierungen • Probleme mit Kofaktoren, Kofaktorregenerierung sowie Multienzymsystemen • Aktivitätsverlust und/oder Veränderung der Enzymeigen-schaften

39. Überlegen Sie Beispiele! Welche Interaktion sind beteiligt? Wie beeinflusst der pH Wert bzw. die Ionenstärke nicht-kovalente Wechselwirkungen bzw. die Reaktivität der individuellen Aminosäuren-seitenketten. • Prinzipien der Immobilisierung • Parameter der Immobilisierung - Enzym • Funktionelle Gruppen an der Proteinoberfläche, d.h. hauptsächlich Carboxylatgruppen von Glu und Asp sowie Aminogruppen von Lys und Guanidinogruppen von Arg werden für die kovalente Bindung verwendet. Oberflächen-Thiolgruppen sind eher selten. • Hydrophile und/oder hydrophobe Komplementarität sowie Ladungskomplementarität von Protein- und Trägeroberflächen sind für die primäre Interaktion (Adsorption) entscheidend, welche der Bildung einer kovalenten Bindung vorgeschaltet ist. • Komplementarität kann durch Protein- und Träger-Engineering verbessert werden. Überlegen Sie Beispiele dazu.

40. Parameter der Immobilisierung - Träger • Gewünschte Eigenschaften eines technologisch nützlichen Trägers sind: • Chemisch - geringe Quellfähigkeit; hohe chemische Stabilität; gute Stabilität gegen mikrobiellen Abbau; günstige Oberflächenbeschaffenheit (Hydrophilie / Hydrophobizität) • Morphologie - Teilchendurchmesser im Bereich von 0.2 bis 1 mm in möglichst enger Größenverteilung (keine Nanopartikel - warum?); Porengrößen im Bereich von 30 bis 60 nm; große innere Oberfläche für die Adsorption bzw. Bindung (z.B. 100 - 250 m2 g-1; Anmerkung: Trypsin mit einer Molmasse von 23.8 kDa benötigt eine Oberfläche von 15 nm2). • Mechanisch - gute Druckbeständigkeit und geringe Kompressibili-tät; ausreichende Elastizität, zumindest so, dass es durch Rühren zu keiner Abreibung kommt. • Allgemein - Lebensmitteltauglichkeit; geringe Kosten • Mögliche Einteilung in anorganische, natürlich organische, und synthetisch organische Träger (I, industriell; L, Labor) • Anorganische - Poröses GlasI,L; Poröses Silika (Deloxan)I; AlumnosilicaI; reaktive Gruppe immer -OH.

41. Natürlich organische - Polysaccharide (Derivative der AgaroseL; quervernetzte DextraneL; partikuläre und derivatisierte Cellulose wie z.B. DEAE-Cellulose oder Carboxymethyl-CelluloseI,L); Proteine (Gelatin; quervernetzte BiomasseI); reaktive Gruppe immer -OH bzw. die Derivatgruppe (außer Proteine). • Synthetisch organische - Acrylat Kopolymere (Eupergit)I,L, reaktive Gruppe -COOH; Acrylamide Kopolymere, reaktive Gruppe -CONH2; Polyamid (Nylon)I,L, reaktive Gruppe -NH2 ; Vinylacetat; reaktive Gruppe -COOH; Derivate von Polystyrol oder PolypropylenI; reaktive Gruppe Anilino. • Aktivierung des Trägermaterials • Hydroxygruppen des Trägers eignen sich nicht gut für die Folgechemie. Eine bewährte Methode ist die Derivatisierung mit Aminopropyl Triethoxysilan, wobei eine Aminoalkylfunktion eingeführt wird. Durch Einsatz von bifuntionellen Reagenzien, z.B. Glutardialdehyd, kann das Protein über eine Aminogruppe mit der Aminogruppe des Trägers gekoppelt werden. Reduktion der Schiff Basen ist meist nicht nötig. • Eine Vielzahl von Kopplungsreaktionen stehen prinzipiell zur Verfügung (siehe Organische Chemie; Buchholz et al. 2004. Biocatalysts and Enzyme Technology, Wiley-VCH).

42. Abbildungen: Kopplungsreaktionen für silanisierte Oberflächen mit freien Hydroxygruppen (links) und Eupergit (rechts). • Kommerzielle Ionenaustauscher sind zum Preis von 5 bis 25 Euro pro Liter erhältlich. Träger in diesem Kostenrahmen werden industriell bevorzugt. Weitere sehr billige Träger sind Tonerde, Bentonit oder Metalloxide. • Eupergit ist wesentlich teurer (mind. Faktor 10), sodass die Trägerkosten für viele Anwendungen prohibitiv sind.

43. Immobilisierung von ganzen Zellen • Vorteile sind • einfache Aufarbeitung ohne Zellaufschluss und Reinigung • Reaktionssequenzen und Multischritttransformationen können einfacher durchgeführt werden • Kofaktorregenerierung einfach möglich • Schutz gegen Scherkräfte und Grenzfächeneffekte • Nachteile sind • Stabilität der Zellen oft ungenügend • Nebenproduktbildung durch komplexe Proteinmatrix der Zelle • Massentransportlimitierung treten häufig auf • geringe Aktivität des gewünschten Enzyms in der Zelle (mit rekombinanten Enzymen meist, aber nicht immer lösbar, z.B. Membran-gebundene Polyoldehydrogenase in Gluconobacter sp., welche die Oxidation von Sorbit zu L-Sorbose katalysiert).

44. Abbildung: Die dargstellten Methoden der Immobilisierung können ergänzt werden durch vor- oder nachgeschaltete Flockulierung und Agglomeration. Materialien für Adsorption und Adhäsion (inkludiert der Adsorption nachgeschaltete Reaktionen wie Vernetzung) sind Sand, poröse anorganische Materialien, Polyurethan und andere organische Polymere, Aktivkohle, ... Der Einschluss in Gele aus Polyvinylalkohol oder in ionotrope Gele ist eine milde Methode, die sich vor allem für empfindliche Zellen (Pflanzen, Tiere) gut eignet. Ionotrope Gele bilden sich, wenn wasserlösliche Polyelektrolyte feste, gelartige Netzwerke durch Quervernetzung mit (Poly)Kationen oder (Poly)Anionen bilden. Wichtig ist, dass Diffusionkoeffizienten für niedermolekulare Substrate (z.B. Glucose; D ≈ 7 x 10-6 cm2 s-1) in diesen Gelen praktisch gleich sind wie in Wasser (keine Limitierung!). • Methoden der Immobilisierung für Zellen

45. Abbildung: Materialien zur Herstellung von ionotropen Gelen für die Zellimmo-bilisierung. Abbildung: Methoden zur Herstellung sphärischer Partikel von ionotropen Gelen, in die Zellen eingeschlossen sind (links). Fotographische Dokumentation der Kügelchen (rechts), die mit den nebenstehenden Verfahren hergestellt wurden. Syringe Method: dp ≈ 2,5 mm; Jet Cutter: dp ≈ 0.5 mm. Die Größenverteilung der Partikel ist bei Verwendung des Jet Cutter enger.

46. Charakterisierung von immobilisierten Enzymen • Unter der Annahme, dass ein unteres Limit für STY [= (S0 - St) / Dt] im industriellen Prozess vorgegeben ist, stellt sich die Frage, welche volumensbezogene Aktivität (und daher auch Menge) an Biokatalysator (Vmax,0) einzusetzen ist, um die minimale STY zu erzielen. • Mathematisch kann die nötige Beziehung so ausgedrückt werden: • Der Nenner der Gleichung drückt den Einfluss der Enzymkinetik aus. Die einfachste Form der Michaelis-Menten Kinetik (1-Substrat; keine Produkthemmung; keine Inaktivierung des Enzyms) kann in integrierter Form wie folgt geschrieben werden: • Vmax,0 = [(S0- St) + Km ln (S0/St)] / Dt

47. Der Effekt der Enzyminaktivierung wird durch den Term im Nenner ausgedrückt, wobei ki die Inaktivierungskonstante ist. Beachten Sie, dass [1 - exp (-kiDt)]/ ki die Dimension der Zeit (Dt) hat, wobei [1 - exp (-kiDt)] dem Anteil an inaktiviertem Enzym entspricht. • h ist ein stationärer Effektivitätsfaktor, der das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten des immobilisierten Enzyms und des freien Enzyms angibt. Abbildung: Darstellung der Faktoren, die STY in einem Reak-tionssystem limitieren können: die maximal einsetzbare Konzentration an Katalysator und die maximale Massentransportrate. Chemische Reaktionen laufen häufig bei höheren STY Werten als biochemische Transformationen, sowohl in vitro und in vivo. Der Partikelradius beeinflusst die maximale Massentransportrate!

48. Zusammengefasst bedeuten die Überlegungen, dass STY als Funktion von Vmax,0 limitiert wird durch • die maximale Menge an Substrat, die an das Partikel mit immobilisiertem Enzym pro Zeiteinheit transportiert werden kann, und • die maximale Konzentration an Biokatalysator, die technisch sinnvoll eingesetzt werden kann. • In jedem Fall ist die genaue Charakterisierung des trägergebundenen Katalysators essenziell. Neben den Eigenschaften des Partikels und des immobilisierten Enzyms sind auch Konzentrationsgradienten ausserhalb und innerhalb des Partikels zu berücksichtigen. Abbildung: Konzentrationsgradienten ausserhalb eines sphärischen Partikels mit Radius von ≈ 300 µm mit gebundener Glucoseoxidase, welche die Oxidation von Glucose mit O2 katalysiert. Der Einfluss der Rührung, ausgedrückt in der dimensions-losen Sherwood Zahl, ist gezeigt. Die ungefähre Dicke der Diffusionsschicht Flüssig-Fest wird durch den Schnittpunkt der Tangenten angegeben: d (gerührt) < d (ungerührt). O2 Messung mit Mikroelektrode mit einer Spitzendicke von wenigen µm.

49. Der stationäre Effektivitätsfaktorh setzt sich zusammen aus einem externen Anteil (bedingt durch Filmdiffusion; he) und einem internen Anteil (Diffusion innerhalb des Partikels; hi). Der genaue Beitrag von he und hi ist aber experimentell häufig schwer zu bestimmen. • Daneben gibt es auch einen operationalenEffektivitätsfaktor ho, welcher die Zeiten vergleicht, die zur Erreichung eines erforderlichen Ergebnisses (z.B. Umsatz) mit immobilisiertem und freiem Enzym nötig sind. Abbildung: Vergleich der Effektivitätsfaktoren h (stationär; links) und ho (opera-tional; rechts). In der Praxis sind beide wichtig. Der operationale Faktor vor allem im Hinblick auf STY und Vmax,0 .

50. Wovon hängt die maximale Transportrate an das Tägerpartikel ab? • TR = ApkLa S(∞) wobei TR die Transportrate ist, Ap ist die volumensbezogene äußere Oberfläche des Partikels, a ist die Konzentrationsänderung innerhalb der Diffusionsschicht als Anteil der Bulk-Konzentration des Substrates S(∞), und kL ist der Massentransportkoeffizient. • kL kann ausgedrückt werden als DsSh / 2R oder auch als Ds /d wobei Ds der Diffusionskoeffizient von S ist, Sh ist die Sherwood Zahl (= kL 2R/d). • Für den Fall, dass unter TR-limitierten Bedingungen bearbeitet wird , ist es wichtig zu wissen, wie TR erhöht werden kann. • kL lässt sich durch höhere Rührerdrehzahl im Rührkessel bzw. erhöhte Flussrate im Festbettreaktor steigern. • Die Verkleinerung des Partikelradius und die Erhöhung der Substratkonzentration sind weitere Faktoren. • In Festbettreaktoren sind Partikelradien zumeist bei 100 bis 200 µm, um hohe Druckwiderstände zu vermeiden.