国内外奶牛胚胎移植技术研究及产业化进展

1. 国内外奶牛胚胎移植技术研究及产业化进展 北京安伯胚胎生物技术中心 余文莉

2. 第一部分 奶牛胚胎移植及相关技术的 研究进展

3. 奶牛胚胎移植技术 • 定义 • 是指对生产性能优良和遗传性稳定的母牛经过超数排卵处理后，将多出自然排卵数几倍的受精卵取出，或者将通过体外受精方式获得的胚胎，分别移植到生理状态相同的受体母牛体内，使之产出优良后代的技术。

4. 1 4 2 3 充分发挥优良母畜的繁殖潜力，成倍提高繁殖效率 用MOET技术培育种公牛，加大选择强度，缩短世代间隔 建立基因库，保存品种资源 代替活畜进行洲际、国际引种 奶牛胚胎移植技术的意义

5. 超数排卵技术 非手术胚胎采集技术 胚胎冷冻/解冻技术 受体牛同期发情技术 非手术胚胎移植技术 奶牛胚胎移植技术的关键技术环节

6. 体外受精技术 A 其它 胚胎性别 鉴定技术 E B 胚胎移植 胚胎性别 控制技术 C D 胚胎分割技术 以胚胎移植为基础的相关胚胎生物技术

7. 国内外胚胎移植及主要相关生物技术的研究成果时间表国内外胚胎移植及主要相关生物技术的研究成果时间表

8. 牛胚胎移植主要专项技术国内外水平比较 *饲养管理水平对技术指标影响较大

9. 奶牛胚胎移植及相关技术 研究进展

10. 1. 超数排卵技术 • 牛超数排卵的目的：最大限度地获得受精卵和可用胚胎 • 牛的超排反应和胚胎质量变异性很大 • 促性腺激素种类、批号、处理时间、剂量、年龄、季节、品种 • 处理时卵巢生理状态、营养状况、繁殖状态和重复超排次数等 • 牛的超排方法：CIDR+FSH+PG(16天) • 目前的研究重点：提高超排效率 1、重复超排：间隔；超排次数 2、抑制素免疫提高牛超排效率 3、与超排有关的基因位点的研究

11. 重复超排效果的比较(数据来自北京安伯胚胎生物技术中心)重复超排效果的比较(数据来自北京安伯胚胎生物技术中心) 注：同列上标大写字母相同者表示差异不显著（P>0.05）

12. 2. 同期发情技术 不同牛同期发情方案的效果比较*（李树静等，2002年） *牛同期发情的目的是便于人工受精和胚胎移植，更适于集约化管理。 受体牛营养状况对同期发情效果有显著影响。

13. 3. 胚胎冷冻技术 • 胚胎程序化冷冻(植冰): • 1.5M乙二醇（0.1M蔗糖），直接解冻移植 进口胚胎检疫条例要求： • 透明带完整； • 0.1%胰蛋白酶洗10次； • 在全封闭的细管中冷冻。 • 胚胎玻璃化冷冻(玻璃化溶液、提高降温速度)： • OPS玻璃化冷冻 • 细管法 • 冷冻环法 • 滴冻法 • 微细玻璃管法、 • 封闭式拉长塑料细管法

14. 4. 胚胎性别鉴定及控制技术 • 胚胎性别鉴定技术： • PCR法（电泳和非电泳鉴定）： • 双引物一步法PCR扩增，耗时65分钟。灵敏度、准确率高、污染率和不反应率低，适于在生产现场应用。 • 2002年，Hasler对7-8日龄的3,964枚体内胚胎及1181枚体外胚胎进行了性别鉴定，在妊娠后经B超测试获得的准确率为雄性为98.7%、雌性为94.4%。 • LAMP法： • 环-媒恒温扩增法，比PCR法更为快速简便，无需电泳，肉眼即可辨别，但鉴定准确率不高，容易产生非特异性扩增。 • 胚胎性别控制技术： • 用分离后的X或Y精子生产体内或体外受精胚胎

15. PCR胚胎性别鉴定与X精子胚胎性别控制技术在奶牛中的应用效果比较（体内受精冷冻胚胎，2002~2010年，李树静等）PCR胚胎性别鉴定与X精子胚胎性别控制技术在奶牛中的应用效果比较（体内受精冷冻胚胎，2002~2010年，李树静等）

16. 不同类型胚胎移植后对妊娠率和产犊情况的影响不同类型胚胎移植后对妊娠率和产犊情况的影响 注： i. 同一列数值中具有相同字母上标示差异不显著(P>0.05)； ii. 同一列数值中具有不同字母上标示差异极显著(P<0.01)。

17. 个人观点 • 胚胎性别鉴定技术和精子分离性别控制技术是以胚胎移植和人工授精技术为基础衍生出的生物技术，它们强化了胚胎移植和人工授精的目的。 • 每项技术都有其特定的应用层面和定位，也有其特定的使用范畴。就象胚胎移植技术不可能取代人工授精技术一样，精子分离技术也不可能取代常规冻精生产，X精子生产的性控胚胎也不可能完全取代性别鉴定后的雌性胚胎。 • 每项技术都有其长处，也有其不尽人意的地方，应该深入研究、取长补短、共同发展。

18. 5. 活体采卵及体外受精技术 • 成年牛活体采卵（OPU）技术： • 盲采法 • 内窥镜法 • B型超声波导引法 卵子回收数为6.04枚每头每次，卵母细胞回收率为42.9％ • 幼畜超排活体采卵技术： • IVF体外受精技术水平：囊胚率在40%左右（43%，阳年生等） • OPU体外受精技术水平：囊胚率在30%左右 • 幼畜超排活体卵的体外受精技术

19. 体内受精胚胎与体外受精胚胎的应用效果分析

20. 6. 胚胎分割技术

21. 双半胚、全胚移植效果比较(李树静等，2009年）双半胚、全胚移植效果比较(李树静等，2009年） 注：同一列数值中具有相同字母上标表示差异不显著(p>0.05)。 同一列数值中具有不同字母上标表示差异极显著(p<0.01)。

22. 7. 提高受体移植妊娠率 • 移植妊娠率是奶牛胚胎移植产业化应用中关键因素 • 受体牛营养状况对移植妊娠率影响显著；季节、胚胎质量、冷冻、取样对移植妊娠率无显著影响 • 提高受体移植妊娠率的研究 • 干扰素 • 滋养层组织

23. 第二部分 奶牛胚胎移植技术 产业化发展历程

24. 何为产业化？ • 经济学定义： • 是指要使具有同一属性的企业或组织集合成社会承认的规模程度，以完成从量的集合到质的激变，真正成为国民经济中以某一标准划分的重要组成部分。 • 全国科学技术名词审定委员会： • 将所设计和实施的胚胎生物工程，形成为创造和满足人类经济需要的物质和非物质性生产的、从事盈利性经济活动并提供产品和服务的产业。

26. 发展规模及速度 国外牛胚胎移植技术发展规模及速度

27. 表6 我国牛胚胎移植技术发展规模及速度

28. 中国与加拿大2008年、2009年奶牛胚胎移植规模比较中国与加拿大2008年、2009年奶牛胚胎移植规模比较 *没有确切的统计数字。？不确定是否做过该项工作和所做的数量。

29. 应用范畴 • 扩繁优秀母牛： • 1990年的统计，美国荷斯坦奶牛核心群母牛的27.5% 和优秀种公牛的44% 来自胚胎移植产生的后代。 • 快速生产优质种公牛： • 目前，北美地区、法国参加后裔测定的青年公牛85%以上的是胚胎移植后代。 • 以胚胎代替活畜引种： • 目前，北美向全球每年出口牛胚胎达29,000枚；我国每年引进牛胚胎1,500~2000枚。

30. 制约我国奶牛胚胎移植技术产业化发展的瓶颈 • 行业不规范 • 成本高 • 尚未形成规范的系谱登记和发行、种公牛排名、后裔测定、DHI测定体系 • 加拿大：LPI(Lifetime Profit Index ) • 美国：TPI (Total Performance Index) • 美、加： Official Pedigree online • 尚未形成市场化推动的种牛拍卖会等商业活动 • 加拿大： National Holstein Shows（Holstein Association Canada，每年2次）

32. 国内外奶牛胚胎移植技术产业化应用效果分析 • 在北美，80%以上的奶牛场做过胚胎移植，在加拿大40－50%的奶牛场一直坚持做胚胎移植，他们把自家牛群中生产性能最好、遗传性能最强的母牛选为供体，选择在美国和加拿大排名前50名的种公牛精液来生产胚胎，移植到自家的育成牛中，使育成牛的第一胎生产高产奶牛的后代。这样待育成牛第一胎产奶生产性能测定出结果后，即可决定该牛是进入核心群、生产群，还是被淘汰。 • 美国的年奶产量在10年内上升上了20%，而同期的母牛头数却下降了10%，胚胎移植技术对其贡献率占70%以上。美、加两国排名前100名的种公牛中90%以上是胚胎移植的后代。 • 2002年全世界共移植奶牛性别鉴定雌性胚胎6700例，其中加拿大为4700例，美国为2000例。 • 自2002年以来，全世界每年生产10~15万枚奶牛体外受精胚胎，其中源自活体采卵的体外受精胚胎不足1000枚；每年移植奶牛体外受精胚胎不足1000头，以活体采卵的体外受精胚胎为主。

33. 国内外奶牛胚胎移植技术产业化应用效果分析 北京安伯胚胎生物技术中心2005~2009年性别鉴定胚胎移植结果(河北) 注：“*”代表该数据为不完全统计的部分数据(截至完稿时2009年胚胎移植的产犊未结束)

34. 奶牛胚胎移植技术的效益体现在哪儿？ 国内品种荷斯坦奶牛与性别鉴定胚胎移植后代的产奶性能统计

35. 奶牛胚胎移植技术的效益体现在哪儿？ 性别鉴定胚胎移植对母牛群体扩繁的影响 注：同一列数值中具有相同字母上标表示差异不显著(p>0.05)。 同一列数值中具有不同字母上标表示差异极显著(p<0.01)。 同一列数值中具有相同字母不同大小写之间表示差异显著(p<0.05) *表示胚胎移植结合人工授精的繁育技术路线。

36. 高产奶牛 优秀种公牛 超数排卵 常规冻精 X 冻 精 性别鉴定 常规胚胎 胚胎组织块 性控雌性体内胚胎 性鉴雌性体内胚胎 性鉴雄性体内胚胎 对应的胚胎冷冻解冻技术 移植到各地区同期发情的合格受体牛 高 产 优 质 母 牛 犊 计算机管理系统 发展模式

37. Thank You !