仪器分析课程

1. 仪器分析课程 凝胶过滤和亲和层析 中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所

2. 凝胶过滤（Gel filtration） 一、概念：以多孔凝胶材料为固定相，利用材料的分子筛特性，按照样品分子的大小和形状对组分进行分离的一种液相色谱。 二、原理：在凝胶色谱柱中，凝胶颗粒之间和内部孔径均充满了溶剂。洗脱时，样品随溶剂一起通过色谱柱。由于各组分分子大小和形状不同，所以进入孔径的能力不同。不能进入任何孔径（或称完全被排阻在孔径外）的大分子将从颗粒间隙通过，最先被分离出来。而较小的分子要经过颗粒的间隙和部分内部孔径，因此以一个较慢的速度通过色谱柱，并随分子的大小和形状不同产生差异，达到分离的目的。

3. 三、凝胶过滤的材料 最常使用的材料是聚合的有机化合物，它们都具有立体的孔型网状结构。 （一）、交联葡聚糖（Sephadex） 交联葡聚糖为葡聚糖与表氯醇交联得到的，改变交联度可以得到不同类型的Sephadex。 排阻极限：被凝胶完全排阻在孔外的大分子的最低分子量，称为凝胶的排阻极限。 吸水值：1克干胶在完全膨胀后凝胶颗粒所吸取的水量。

4. 一些Sephadex凝胶的特性 1) 任意卷曲的多糖 2）多肽和球蛋白 Sephadex在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸溶液中稳定，在强碱中糖苷键被水解。可在100℃高压消毒40分钟。

5. （二）、琼脂糖凝胶（Sepharose） 由琼脂制成的线性多糖，由D-半乳糖和3，6-脱水L-半乳糖交替组成。 一些Sepharose凝胶的特性 可适用于pH3-11，低于此pH，葡聚糖可能水解。可耐受清洁剂、SDS、盐酸胍等。可高温消毒。

6. 四、凝胶过滤的参数和公式 对于某一种凝胶，一种溶质在其内部和外部溶剂之间的分配由一个分配系数Kd决定，它是溶质分子大小的函数。 如果是大分子溶质，完全被凝胶内部所排阻，则Kd = 0，如果溶质分子足够小，完全进入内部溶剂，则Kd = 1，由于凝胶内部孔径大小不同，对于中等大小溶质，可以进入部分内部溶剂，不能进入全部内部溶剂，Kd就在0与1之间变化。

7. 对于一个凝胶过滤柱，有几个体积的参数： Ve为洗脱体积，即样品被洗脱出层析柱的体积， V0为外水体积，即凝胶颗粒间隙中溶剂的体积， Vi为内部体积，即凝胶内部孔径中溶剂的体积。 Vi = a·Wr，a为干胶重，Wr为吸水值。 这些体积间存在关系式 Ve = V0 + Kd·Vi，也即 Kd = ，为特征值。

9. 对于两种不同分子量和Kd值（Kd’和Kd’’）的物质，它们的洗脱体积之差Vs应是对于两种不同分子量和Kd值（Kd’和Kd’’）的物质，它们的洗脱体积之差Vs应是 Vs = Ve’ –Ve’’ = ( Vo + Kd’Vi ) – ( Vo + Kd’’Vi ) = (Kd’ – Kd’’)Vi

11. 五、凝胶过滤的应用 （一）纯化：对生物大分子的纯化。如病毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸和多糖等。 （二）分子量的测定：球形蛋白质的洗脱体积主要是由它的分子量决定的，在一个相当的分子量范围内，洗脱体积大约是分子量对数的线性函数。用相同形状的和已知的蛋白质作出一条校正曲线，测定洗脱体积后可从校正曲线得到分子量。 （三）溶液的浓缩：加入干胶，溶液的水和小分子被膨胀的凝胶吸收。 （四）脱盐：盐可被看作是小分子。 （五）测定平衡常数：例如药物的蛋白结合率。药物本身分子量较小，与蛋白结合后成为分子量较大的物质，通过凝胶过滤将二者分开。

12. 六、凝胶过滤的实验设计 目的：包括达到最好的分离，最大的回收率，最小的样品稀释，尽可能短的分离时间。 分辨率（Rs）= 可反映分离的效果，当 Rs≥1.2时，表明基线分离。

13. （一）、凝胶类型的选择 1.组分离：当两种成分分子量差距很大时采用，例如脱盐。凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外水（Vo），区带窄，稀释少。低分子量的洗脱体积接近Vt。脱盐一般推荐Sephadex G-25。 2.分级分离：当分离几种分子量接近的组分时，应该使用各种凝胶的选择性曲线，避免几种成分的洗脱体积接近Vo或Vt。 3.分子量测定：要使样品分子量落在选择性曲线的线性部分及处于校正标准品的中间。一般推荐使用Sephacryl S-200 superfine, Sephacryl S-300 superfine或Sepharose CL-6B。这些胶对水溶性差使用助溶剂不会造成影响。 如果可选择的胶有交搭，应该选择较低排阻极限的，这样可以分离的时间短，回收率高。

14. （二）、凝胶级别的选择 1.细的（20-80μm）： 2.超细的（10-40μm）：以上二者区带窄，分辨率高。 3.中等的（50-150μm）： 4.粗的（100-300μm）：以上二者流速快，适用于制备，组分离。

16. （三）、层析柱的选择 1.柱长：两个区带的分辨率与柱长的平方根成正比。 2.柱内径：大小由载样量决定。 3.加样装置：样品进入凝胶前避免稀释。 4.死体积：样品经柱分离后避免再混合。 5.层析床支持物：避免阻塞。

17. （四）、样品量 较难的分离：样品体积占床体积的1-5%。 组分离和一般分级分离：可根据情况，加大样品量。

19. （五）、样品浓度和粘度 凝胶过滤在很大程度上与样品浓度无关，但除了溶质的溶解性以外，样品的粘度限制了浓度的增加。

20. （六）、洗脱剂 洗脱剂的组成不直接影响凝胶过滤的分辨率。 完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。 带电荷的物质可以用Tris-HCl、磷酸盐缓冲液，Sephadex和Sepharose用离子强度0.02M以上缓冲液，Sephacryl用离子强度0.05M以上缓冲液，防止与基质间的离子作用。NaCl也可采用。如果产物要冷干处理，可采用挥发性的缓冲液如乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙二铵等。 最重要的要考虑洗脱液对样品的作用，如pH、离子强度、清洁剂等，是否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、激素的活性。

21. （七）、洗脱的流速 当洗脱的流速增加时，色谱的分辨率降低。 可根据不同的目的选择适合的流速。要求得到好分辨率时，要采用长层析柱和慢流速。要得到快速分离，可采用短层析柱和快流速。好分辨率与快速分离不可兼得。

22. （八）、优化 有时不是一次就可以得到很理想的分离条件，可通过优化来选到。例如： A : IgG, B: transferrine, C: α-chymotrypsinogen IgG与transferrin已无法在保持好分辨率的情况下加快洗脱速度。 Transferrine 和α-chymotrypsinogen的分离可以加快流速，分辨率仍可为2.25。 如改变柱长，使分辨率为1，柱长约为17cm，分离时间由30小时变为35分钟。

23. 六、凝胶过滤的实验 （一）、凝胶的准备 Sephadex 干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。 不同类型的凝胶膨胀的时间不同： G-25, G-50 膨胀过夜 G-75 一天 G-100 二天 G-200 三天 在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。 Sephacryl, Sepharose, Sepharose CL是膨胀好的。

24. （二）、装柱 • 将凝胶悬液调成大约75%。 • 用负压泵脱气。 • 如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。 • 层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。 • 排掉层析床支持物内的气体。 • 层析柱调到垂直位置。 • 凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。

25. （三）、检查层析柱 以蓝葡聚糖2000（2mg/ml）为样品，观察色带在柱内洗脱时移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。 （四）、加样 1.手工加样 2.加样阀加样 要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。 （五）、洗脱 洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。 （六）、凝胶的清洗 凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，需清洗后才能恢复原样。 Sephadex,，Sepacryl， Sepharose CL 可用0.2M NaOH。 Sepharose 可用4<pH<9缓冲液及非离子清洁剂。

26. (七)、凝胶的储存和防止微生物生长 使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的生长，抗菌剂必须不与样品作用。 通常用的防腐剂有：叠氮钠 0.02% ，三氯丁醇 0.05% ，硫柳汞 0.005% ，洗必太 0.002% ，汞苯盐（乙酸:硝酸）0.001-0.01%。 Sephadex,，Sephacryl,，Sepharose和Sepharose CL都可以在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在4℃冷藏，但要防止冻结，因为冻结将破坏凝胶颗粒。 Sephadex可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐和杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍浓一些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用96%乙醇，使胶皱缩，布氏漏斗抽虑，60-80℃烘干。

28. 亲和层析(affinity chromatography) 一、介绍 （一）、概念：亲和层析是利用配位体和大分子相互作用时所固有的独特的生物学特性建立的一种吸附层析. 这种相互作用包括： 酶----底物、产物、抑制物、辅酶和变构调节剂 激素----结合蛋白、细胞受体 基因----核酸、阻遏蛋白 抗体----互补抗原 植物外源性凝集素----红细胞、淋巴细胞的表面抗原、某 些糖和多糖

29. （二）、层析原理 1.以共价键将配位体与不溶性基质连接，制成层析床。 2.将欲分离样品加到柱上，与配位体有亲和性的大分子被保留，其它直接流过。 3.改变洗脱剂组成，使吸附大分子解离和洗脱。

31. （三）、亲和层析的吸附剂 1、基质 1）、理想基质的性质 (1)不溶性基质应具备松散的多孔网络，大分子可以均匀和不受阻碍地进出，并具有良好的流动性。 (2)凝胶颗粒应为规则球形，并具刚性，有利于流动和耐受静压。 (3)基质的化学性质必须是惰性的，基质骨架与蛋白质等的反应必须极弱以降低非特异 性结合吸附作用。 (4)凝胶的理化性质必须稳定，不因偶联配位体和吸附、洗脱互补大分子所应用的条件而发生变化。 (5)基质必须有能活化或修饰的功能基，并且数量充足，以便能偶联较多的配位体。

32. 2）、有实际应用价值的基质 (1)纤维素 (2)交联葡聚糖 (3)琼脂糖 (4)交联琼脂糖

33. 2、间隔臂 配位体直接和基质骨架偶联，它与互补蛋白质的相互作用将受到空间阻碍的影响。配位体必须远离网络骨架。一般是将配位体与基质骨架间加入一段长链，称为间隔臂。

34. 1）、间隔臂的长度 一般认为，为了互补大分子获得最佳相互作用，配位体与骨架间必须插入至少4到6个亚甲基的臂。然而，当互补大分子的分子量低或与配位体亲和性高，则间隔臂长度不像大蛋白质分子或低亲和系统中那样严格。 目前还有采用长链间隔分子的,如聚赖氨酰丙氨酸，分子量约260,000，纯化作用较短链强。 2）、间隔臂的性质 惰性间隔分子：原认为脂肪族碳氢化合物是惰性的，但是实验证明存在空间干扰和非特异吸附。 亲水性间隔分子：在长轴方向引入极性基团，如二级胺、羟基、肽能极大降低非特异性吸附作用，但亲和层析结果不好。 疏水性间隔分子： 甘氨酸倍半肽（亲水）对肝葡糖激酶吸附差 6-氨基乙酸（疏水）对肝葡糖激酶吸附好

35. 3、配位体 配位体对欲纯化的溶质有特异的亲和性. 1）、大分子与配位体的亲和力 配位体与互补大分子间的亲和力是选择高效固定配位体要考虑的一个重要因素。解离常数应在10-4—10-8，当>10-4时，亲和力太低，不易成功分离，<10-8时，亲和力太高，不易保持活性洗脱。 式中，E为酶浓度，L为配位体浓度， EL为酶-配位体复合物， KL为解离常数 KL= =

36. KL= L0, ) = E0, L0为起始浓度，大多数情况下L0>>E0, L0>>EL, 2）、配位体和基质的连接方式 不溶性底物必须具有功能基，经化学修饰可与基质连接，并且不损害或破坏与互补酶的相互作用。这使配位体选择和连接方式带来难度。 e表示位点不与互补酶作用，其它任何位点（a-d）连接生成的吸附剂不是部分有效就是无效。

37. 腺嘌呤核苷-5’-单磷酸与基质连接有几种方式，其中乳酸脱氢酶与（a）结合最强，（c）次之，（b）再次，（d）无亲和性。腺嘌呤核苷-5’-单磷酸与基质连接有几种方式，其中乳酸脱氢酶与（a）结合最强，（c）次之，（b）再次，（d）无亲和性。

38. / ( ) [EL]= 3）、配位体的浓度 式中表明以单位体积凝胶所含克分子数表示的结合酶[EL]浓度受到固定配位体浓度的限制。 但实际上凝胶中配位体表观或有效浓度约为化学测定值的1%或更低。一般采用最大配位体浓度。 对于亲和力强不易洗脱的情况，减少配位体浓度即可将蛋白质在较温和地条件下洗脱下来。 如果配位体具有电荷，浓度过高能引起色谱畸变。一般认为配位体浓度在10-3M,对酶的纯化效果最好。因为<10-3M, 配位体彼此相距较远，足以防止非特异性蛋白质同时与一个以上带电配位体发生相互作用。

39. 二、偶合胶 在凝胶基质上连接某种功能基团，可以快速、容易、安全地固定配体，这种凝胶称偶合胶。 1、常用的偶合胶 结合含伯氨基配体 结合羧基配体 结合氨基配体 结合含胺基 配体 结合含羧基、胺基、巯基 结合巯基配体 结合巯基、重金属、卤化脂、肪烃及、可与含C=O、C=C、N=N者加成. （1）溴化氰活化的琼脂糖4B： （2）AH-琼脂糖4B：具6碳臂， （3）CH-琼脂糖4B：具6碳臂， （4）活化的CH-琼脂糖4B：具6碳 臂和活性脂， （5）环氧活化的琼脂糖6B：具亲 水臂， （6）活化的含硫琼脂糖4B：具谷 胱甘肽臂， （7）含硫丙基琼脂糖6B： 具亲水 性臂，

40. 2、配体与溴化氰活化的琼脂糖4B的偶合方法： (1)膨化和洗涤胶 a.1mM HCl将冷冻干燥的粉末膨胀15分钟 b.垂熔漏斗过滤下，用盐酸洗涤 (2)偶合配体 a、配体溶液的配置，用偶合溶液(0.1M NaHCO3, pH8.3, 含0.5M NaCl)溶解配体蛋白质(5-10mg/ml胶) b.用偶合溶液洗涤胶数次 c.立即将配体溶液倒入胶内并搅拌(不能用电磁搅拌)。这个步骤要迅速，因为在这个pH下胶的活性基团易破坏。室温2小时，4℃过夜。 (3)阻断过剩的活性基团.偶合之后,一些活性基团仍保留在胶上,应采取 a、温和的碱溶液过夜或Tris-HCl缓冲液2小时 b、加过量的小的伯胺(1M乙醇胺或0.2M甘氨酸等) (4)洗涤产物 为了去掉偶合后游离的配体，偶合缓冲液，乙酸缓冲液洗涤产物，以保证没有游离配体以离子形式与固定配位体结合，同时洗掉阻断剂。 (5)储存 4-8℃， 加抗生剂。

41. 三、基团的特异吸附剂 基团的特异吸附剂是对有关物质的某一基团，而不是单一物质的亲和。因此同一配体可用于纯化若干物质（例如酶系列），而不需要对每一个被纯化的不同物质准备不同的吸附剂。基团特异亲和层析的特异性来自两个方面，一是配体的选择性，二是使用选择性的洗脱条件。

42. 1、常见的基团特异吸附剂

43. 2、应用实例 用蓝琼脂糖CL-4B分离醇脱氢酶等，样品为酵母粗提物，溶于初始溶剂（5×10－3M MgCL2， 4×10－4M EDTA, 2×10－6M 2－巯基乙醇的0.02M Tris/Hcl溶液，pH6.4）。载样后洗脱。 初始溶液 峰1 非活性物质 5mM NAD+(A) 峰 2 醇脱氢酶 10mM NADP+(B) 峰 3 6－磷酸葡萄糖脱氢酶 10mM NADP+ pH8.6(C) 峰4 己糖激酶 10mM NAD+ pH8.6(D) 峰5 3－磷酸甘油醛脱氢酶

44. 四、亲和层析的实验技术 1、方法： 色谱柱法 2、缓冲液的选择 平衡吸附剂的缓冲液的pH，离子浓度，温度和化学组成必须使不溶性 配位体与蛋白质之间发生强烈的相互作用。 3、样品体积、流速和平衡时间 （1）样品体积：高亲和力 体积要求不严格 低亲和力 为防止从外水流走，体积要小 （2）速度：配位体与大分子间吸附达平衡很缓慢，所以流速宜慢，特别是样品浓度高时，如果浓度低，速度可快。 （3）平衡时间 增加平衡时间可以增强相互作用，提高凝胶床分辩力，非特异性吸附也有相似效应。

45. N6(6－氨乙基)－AMP-Sepharose上乳酸脱氢酶结合百分率N6(6－氨乙基)－AMP-Sepharose上乳酸脱氢酶结合百分率

46. 4.蛋白质浓度：亲和力一般和较高的系统、互补酶浓度对吸附无大影响，若负载高、流速快，则可能由外水流出。4.蛋白质浓度：亲和力一般和较高的系统、互补酶浓度对吸附无大影响，若负载高、流速快，则可能由外水流出。 5.温度效应：亲和凝胶吸附作用强度随温度升高而减小。 乳酸脱氢酶与固定的AMP相结合的温度效应。洗脱酶所需的还原性辅酶Ⅰ浓度随温度升高而减小。

47. 要重复亲和层析的纯化结果，控制温度十分重要。要重复亲和层析的纯化结果，控制温度十分重要。 利用不同温度吸附和洗脱，对纯化作用也很好，例如于4℃使酶与吸附剂紧密结合，在25 ℃以温和条件洗脱。

48. 6、吸附剂容量： 由两类相关参数决定：1）基质、间隔臂、配位体 2）流速、平衡时间 操作容量的测定 将浓度（Co）互补蛋白质持续加到吸附剂上监测流出情况。当吸附剂饱和时，溶液以进柱时浓度流出，流出物浓度迅速上升，呈台阶式。 每克吸附剂特异吸附被吸附物的量（q）为q=(V/m)Co(m为吸附剂质量) C0 洗脱液中互补蛋白质浓度 V0 V Ve 体积（ml）

49. 7、特异性吸附剂蛋白质的洗脱 （1）洗脱方法 a．分段洗脱法：在惰性蛋白质流出后，更换缓冲液，包括组成，pH、离子浓度或温度的改变。 b．梯度洗脱法：连续改变缓冲液浓度，使洗脱能力逐渐加强。 （2）非特异性洗脱法：比较经济，需要改变的因素是缓冲液的pH，离子浓度，介电常数和温度。 （3）特殊洗脱技术： a．利用某些缓冲液特性：例如牛乳糖合成酶的半乳糖基转移酶在锰离子存在下容易吸附在尿苷二磷酸琼脂糖上，用高浓度NaCl(0.5-1.0M)不能洗脱，以pH8.5硼酸缓冲液可以洗脱。 b．选择性断裂基质和配位体之间的键。

50. （4）特异性洗脱技术 a.用与固定配位体相同的游离配位体进行洗脱。 b.用与固定配位体不同的洗脱配位体进行洗脱，这样的层析具有双重特异性。 例如用5mM AMP从8－（6－氨己基）cAMP－琼脂糖上洗脱依赖于cAMP的鱼精蛋白激酶。 c.阴性洗脱：在双底物或多底物存在的亲和系统中，如果撤掉其中某一底物，使被吸附的大分子解吸附。 例：在前导底物100uM NADH存在下，乳酸脱氢酶强烈吸留在固定的丙酮酸类似物上，在洗脱液中不含NADH时，脱氢酶被迅速洗脱。