色谱技术

1. 色谱技术 ——如何选择最佳分离条件

2. 一、色谱的任务 • 色谱的首要任务是分离 • 关键在于建立色谱分析方法——优选最佳色谱分离条件 • 为此要了解影响分离度的因素 • 掌握建立色谱分析方法——优化色谱分离条件的一般步骤

3. 二、衡量分离的指标——分离度 • 分离度：Rs=1.5 —基线分离—完全分离

4. 二、影响分离度的因素 • 受动力学因素和热力学因素两方面的影响 • 基本分离方程 效率因子 选择性因子 容量因子

5. 1、效率因子(n) • 当固定相确定以后，要使一对组分的分离达到某一分离度，柱必须具有最低限度的理论塔板数(最小柱长)。 • 增加柱长可以提高分离度。 • 减小柱的H可以提高分离度，比增加柱长更可取。

6. 2、容量因子(k’) • 容量因子(k’)增加，Rs增加。 • K’合适的范围：1~20 • 使k’改变的方法有；改变柱温；改变流动相性质及组成(在液体色谱中)；改变相比。

7. 3、选择性因子(α) • α越大，柱选搀性越好，越能获得良分离 • 三个参数中，α的增加对分离度的提高最有效 • 改变方法：改变固定相、改变流动相、改变柱温、改变样品结构——衍生化

9. 三、如何提高柱效 • 基本概念：理论塔板数n，理论塔板高度H • 板高(H)越小，柱效(n)越高，峰宽(W)越窄 • 影响柱效的因素——速率理论 • H=A+B/u+C*u

10. 1、涡流扩散项(A) • 当组分随流动相向往出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒的阻碍不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，导致谱带展宽，故称涡流扩散。 • 采用小颗粒固定相，填充均匀可提高柱效 填充不规则因子 固定相颗粒直径

11. 2、纵向扩散(B) • 纵向分子扩散指沿X轴方向的扩散，它是由浓度梯度造成的。 • H2=k*Dm • Dm—组分分子在流动相中的扩散系数 • 与流动相流速成反比

12. 3、传质阻力项(C) • 组分分子在两相之分配时受到的阻力 • 流动相中的传质阻力Cm=K*dp2/Dm • 液相色谱中减小流动小粘度可以增大Dm

13. 3、传质阻力项(C) • 固定相的传质阻力Cs=K*df2/Ds • 减小液膜厚度 • 减小固定液粘度 • H3=Cm+Cs • 键合项液相色谱中Cs可以忽略 • 气相色谱中Cm可以忽略

14. 4、速率方程 • H=A+B/u+C*u ——操作条件

15. 5、其他导致峰展宽的原因 拖尾的原因

16. 6、保护色谱柱

17. 四、改变组分k’和α • 液相色谱：改变流动相 正相色谱——吸附色谱(薄层色谱) 反相色谱——键合相色谱、反相离子对色谱(HPLC) • 气相色谱： 毛细管色谱——柱温、 固定液

18. 1、调节组分k’值 • 液相色谱——通过改变流动相极性调节组分k’值。 • 溶剂极性与洗脱能力： 正相色谱——极性强洗脱能力强，组分k’减小 反相色谱——极性弱洗脱能力强，组分k’减小 • 各种溶剂的极性——ε0、P’ • 混合溶剂的极性

19. 2、改变选择性(α) • 根据分子间作用力将溶剂分组 • 不容组的溶剂选择性不同 • 根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性

22. 五、确定最佳溶剂强度 • 一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k’。当所有谱峰符合1＜k’＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度)

28. 五、确定最佳溶剂强度 • 另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k’值符合1＜k’＜20范围的大概溶剂成分。

29. 六、优化流动相的选择性 • 三角形优化法(反相HPLC)

32. 正相色谱

34. 七、离子对色谱法 • 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术 • 关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。

35. 1、基本原理 • 有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+，B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。离子对的生成可由下式表示： • A-水相B+水相A-B+有机相分别表示组分离子A-、平衡离子B+、离子对A-B+有机相在水相和有机相中。

36. 1、基本原理 • 由于离子对具有硫水性，因而被非极性固定相(即有机相)提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。 • 以上这类色谱法称反相离子对色谱法。

37. 能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多宫能团化合物的分离。能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多宫能团化合物的分离。 • 可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。

38. 2、反相离子对色谱法 • 固定相和流动相 在反相离子对色谱中，采用类似于反相键合相色谱中所使用的固定相。 流动相为加有平衡离子和有机溶剂(如甲醇或乙腈)的缓冲水溶液。平衡离子为四丁铵、烷基磺酸盐等。

39. 3、影响保留值的因素 • 离子对试剂 若组分离子和平衡离子只溶于水相，生成的离子对只溶于有机相，则离子对生成反应的平衡常数(又称提取常数)，可表示为： 对于某一特定的离子对分配体系，E为常数，但它随着流动相的PH值、离子强度、流动相中有机溶剂浓度和种类、温度的改变而变化。

40. 离子对试剂 组分离子在两相问的分配系数可表示为： 可见，分配系数与提取常数和平衡离子的浓度成正比。

41. 组分离子的保留值受离子对的疏水性和平衡离子的浓度所控制。离子对疏水性越强，在非极性固定相上的溶解度越大，则保留值越大。平衡离子浓度增加，有利于离子对的形成，保留值也随之增加。但是，当所有组分离子都以离子对形式存在时，保留值为一常数。组分离子的保留值受离子对的疏水性和平衡离子的浓度所控制。离子对疏水性越强，在非极性固定相上的溶解度越大，则保留值越大。平衡离子浓度增加，有利于离子对的形成，保留值也随之增加。但是，当所有组分离子都以离子对形式存在时，保留值为一常数。

44. 溶剂强度 通过改变混合流动相中的溶剂的相对比例，可以改变溶剂强度。流动相中水的比例减少，有机溶剂(如甲醇或乙腈)增加，溶剂强度增加，k’值减少。

45. pH值的影响 以酸为例：在中等pH值内，组分具有最大的k’值。在此范围内，组分完全离解，形成的离子对最多。当pH值降低阴离子开始形成酸分子，因此，进入固定相的离子对减少，组分k’值减小。当流动相pH值较高时，OH-离子很多，它们会与组分离子争夺平衡离子，以形成离子对，使组分离子形成的离子对减少，组分的k’值下降。

46. 离子强度 除平衡离子外，若流动相中还存在其他辅助离子，则使离子强度增加，组分的k’值下降。离子强度加倍，k’值大致变化2—3倍。当辅助离子浓度增加时，会发生两种情况：若辅助离子与组分离子的电性相同，它们为争夺平衡离子而展开竞争；若平衡离子与辅助离子的电性相同，它们为争夺组分离子而展开竞争。

47. 4、改变选择性 • 改变溶剂种类 改变溶剂选择性的方法，类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。

48. 改变pH 组分离子与平衡离子的生成，离子对的形成，都与流动相的pH值密切相关。改变流动相的pH可以改变体系的选择性。流动相的pH值应调节到能使不同组分有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求，只有使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH范围内保持完全离解，因此，只有强酸盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐)和强碱盐(季铵盐)才满足此要求。

49. 酸性越强的组分(A)．在较大的pH范围内，k’都保持极大值。酸性越弱的组分(C)，只有在极窄的pH范围内，k’才有极大值。对于强酸性组分，只有当pH小于1时，才迅速流出柱子，对于弱酸性组分，pH值小于5，就能迅速流出柱子。假如A、B、C同时存在，流动相的pH值为8，则三组分都强烈滞留于拄上，不能分离。若pH调至4，三者完全分离。C最先出柱，A最后出。可见，正确选择流动相的pH值是改善选择性的强有力手段．若预先知道酸或碱的值pK，就可以预测组分的相对保留值怎样随pH值而改变。酸性越强的组分(A)．在较大的pH范围内，k’都保持极大值。酸性越弱的组分(C)，只有在极窄的pH范围内，k’才有极大值。对于强酸性组分，只有当pH小于1时，才迅速流出柱子，对于弱酸性组分，pH值小于5，就能迅速流出柱子。假如A、B、C同时存在，流动相的pH值为8，则三组分都强烈滞留于拄上，不能分离。若pH调至4，三者完全分离。C最先出柱，A最后出。可见，正确选择流动相的pH值是改善选择性的强有力手段．若预先知道酸或碱的值pK，就可以预测组分的相对保留值怎样随pH值而改变。

50. 系统选择 使用一种有机溶剂(甲醇)；流动相的其它三种成分为pH=2.5(B)和pH=7.5(c)的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度(例如：200mM)的离子对试剂的缓冲液(D)。以组合不一的缓冲液(B—D)进行七次实验，并变化甲醇(A)量以保持每次实验的k’值范围大致恒定。