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マウス受精卵操作の基礎技術

マウス受精卵操作の基礎技術. 受精卵採取と培養. 滋賀医科大学動物実験施設 　　　　　　石橋 国夫 　　　　　　寺門 一郎 　　　　　　鳥居 隆三. 受精卵操作技術の必要性. １ . 凍結保存による系統維持が可能. ２ . 施設間の動物輸送（逃亡、病原体の持ち込み防止）. ３ . 経済的理由. ４ . ＳＰＦ化や感染事故後のクリーニング法. ５ . 遺伝子組み換えマウスの作製. 発表内容. 発表内容. 受精卵採取と培養. １ . 供試動物：マウス（系統： ICR ） 　２ . 培養液（ HTF ） 　３ . 採卵、培養の器具と機器

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マウス受精卵操作の基礎技術

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Presentation Transcript

  1. マウス受精卵操作の基礎技術 受精卵採取と培養 滋賀医科大学動物実験施設 　　　　　　石橋 国夫 　　　　　　寺門 一郎 　　　　　　鳥居 隆三

  2. 受精卵操作技術の必要性 １.凍結保存による系統維持が可能 ２.施設間の動物輸送（逃亡、病原体の持ち込み防止） ３.経済的理由 ４.ＳＰＦ化や感染事故後のクリーニング法 ５.遺伝子組み換えマウスの作製

  3. 発表内容 発表内容 受精卵採取と培養 １. 供試動物：マウス（系統：ICR） 　２. 培養液（HTF） 　３. 採卵、培養の器具と機器 　４. 交配（誘起排卵と自然排卵） 　５. マウスの開腹 　６. 受精卵の採取 　　膨大部切開による受精卵の採取 　　卵管還流による受精卵の採取 　７. 培養による受精卵の発生過程 　８. 採卵数と培養結果

  4. マウス マウス：系統Jcl:ICR ９〜１９週齢

  5. 培養液

  6. 実体顕微鏡 実体顕微鏡（１５〜９５倍ズーム） ホットプレート

  7. 培養器 炭酸ガス培養器 CO2：５％ 温度：３７℃

  8. 器具 使用器具

  9. 採卵 採卵用ピペットの使用方法

  10. 採卵用ピペット 採卵用ピペットの作り方 （パスツールピペット使用） ガラスが軟らかくなるまで熱する 炎から離し15〜20㎝引く アンプルカッターで傷を付け折る 先端外径150〜200μm

  11. 発情周期 マウスの発情周期（４〜５日）

  12. 過排卵 誘起排卵（過排卵）処理の方法 １.自然排卵より多くの卵を採取できる ２.発情周期に無関係に交配可能 PMSG(妊馬血清性性腺刺激ホルモン） (卵胞刺激ホルモンにかわるもの) 生理食塩水に溶かし、１匹当たり５単位を腹腔内投与 hCG(ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン) （黄体形成ホルモンにかわるもの） PMSG投与から48時間後に５単位を腹腔内投与。 投与後、雄マウスと同居

  13. 投与法 保定と腹腔内投与 1.PMSG投与 48時間後 2.hCG投与 3.交配

  14. 交尾の確認 交尾の確認 : 膣栓(plug) の検査 膣栓なし 膣栓あり→交尾成立

  15. 準備 準備 １.培養液は前日に炭酸ガス培養器に入れておく 　（炭酸ガス濃度が５％であることを確認する） ２.ヒアルロニダーゼを含むPBSをシャーレにとり 　室温に戻す ３.ホットプレートのスイッチを入れ３７℃にする ４.シャーレに微少滴を作る（クリーンベンチ内） ５.実験台、解剖用具をアルコール消毒する

  16. 微少滴 微少滴培養 ５０μℓの培養液滴 ミネラルオイルで覆う

  17. 頸椎脱臼 頸椎脱臼による安楽死

  18. 解剖図 解剖図

  19. 膨大部切開図 膨大部切開による受精卵の採取

  20. 卵管膨大部 卵管と卵管膨大部

  21. 卵丘細胞採取 膨大部の切開 卵丘細胞に囲まれた受精卵

  22. 卵管采還流 卵管采還流による採卵 卵管膨大部消失 ２細胞期胚の採取

  23. 卵丘細胞 卵丘細胞層に囲まれた受精卵

  24. 受精卵変化図 マウスの胚の受精から着床まで

  25. １細胞期胚 １細胞期胚

  26. ２細胞期胚 ２細胞期胚

  27. ４細胞期胚 ４細胞期胚

  28. ８細胞期胚 ８細胞期胚

  29. 桑実胚 桑実胚と８細胞期胚

  30. 胚盤胞 胚盤胞期胚

  31. ハッチング ハッチングした胚

  32. 受精卵の変化 培養による受精卵の変化

  33. 変性卵 培養中の観察 培養液不良による受精卵死亡（２日目） ：未受精卵

  34. 受精卵採取数 受精卵採取数 マウス系統 Jcl:ICR

  35. 胚盤胞率 胚盤胞期胚発生率

  36. 今後の課題 今後の課題 １. 受精卵採取と培養法の技術向上をはかる ２. 受精卵移植の技術を身につける ３. 受精卵凍結保存の技術を身につける 遺伝子組み換えマウスの作製

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