بنام خدا عباس بهرامی عضو هیات علمی گروه بهداشت حرفه ای دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی کاشان

1. بنام خدا عباس بهرامی عضو هیات علمی گروه بهداشت حرفه ای دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی کاشان Bahrami_a@kaums.ac.ir

3. جلسه سوم تجزيه نمونه آلودگيها

4. 1- انواع اسپکتروفوتومتری را بیان کند. 2- قانون بیرلامبرت را توضیح دهد. 3- اجزاء دستگاه اسپکتروفوتومتر را بیان کند. 4- انواع منبع نور را در اسپکتروفوتومتر نور مرئی- ماوراء بنفش بیان کند. 5- دو نوع cell یا کووت را توضیح دهد. 6- نحوۀ تهیۀ منحنی کالیبراسیون را شرح دهد. 7- روش تهیۀ منحنی کالیبراسیون بطریق Standard addition را بیان کند.

5. What is Spectroscopy? The study of molecular structure and dynamics through the absorption, emission and scattering of light. Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

6. اسپكتروفتومتر(Spectrophotometer) اسپكتروفتومتر يا طيف سنج يك دستگاه آزمايشگاهي اوليه است كه جهت خواندن نتايج آزمايش هاي كه واكنش آنها از نوع End point هستند بكارمي رود اين دستگاه ميزان جذب يا عبور طول موجهاي مشخصي از انرژي تابشي (نور) از يك محلول را اندازه گيري مينمايد بيشترين كاربرد آن در آزمايشگاه در بخش بيوشيمي است. اساس كار اسپكتروفتومتر همانند بسيار از دستگاههاي آزمايشگاهي، براندازه گيري ميزان نور جذب شده توسط يك محلول رنگي است كي طبق قانون بير-لامبرت (-LambertBear) ميزان جذب نور(OD) متناسب با غلظت ماده حل شده در محلول است. قانون بير-لامبرت زماني صادق است كه: 1- نور منتشر شده بر روي ماده مورد نظر تك رنگ باشد 2-غلظت ماده حل شده بايد در محدوده خطي باشد

7. The Electromagnetic Spectrum E = hn n = c / l Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

8. X-Ray UV Microwave Visible IR 200nm 400nm 800nm WAVELENGTH(nm) Spectroscopy Spectral Distribution of Radiant Energy Wave Number (cycles/cm) Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

9. Io I b قانون بير لامبرت: Beer-Lambertor Bouguer-Beer شدت نور (اشعه الكترومغناطيسي) جذب شده متناسب با غلظت ماده و طول سل (مسيري كه نور مي پيمايد) دارد. جذب تابش (%T)T: عبور(درصد عبور) : ضريب جذبي مولي L. mol-1 cm-1 b: ضخامت سل (طول مسير عبور اشعه الكترو مغناطيس)cm C: غلظت mol.L-1

10. هر چقدر ضريب جذب مولي ماده بيشتر باشد روش حساس‌تر است (يعني به ازاء b, c ثابت داراي A بيشتري است) ـ ماده‌اي كه هيچ گونه جذب ندارد (يا محلولي كه در آن هيچ ماده جذب كننده‌ تابش وجود ندارد و هيچ كاهشي در شدت تابش ايجاد نمي کند) محلول بلانك يا سفيد ناميده مي شود. دراين مورد مقدار جذب صفر و يا عبور (T) و درصد عبور (%T) صددرصد است.

12. طرز تعيين غلظت يك ماده توسط اسپكتروفتومتري 1ـ تهيه محلول بلانك (يا محلولي كه داراي تمامي گونه‌ها بغير از گونه مورد نظراست)A=0 2ـ تهيه نمونه‌هاي استاندارد از گونه‌ موردنظر با غلظتهاي مشخص C1, C2, C3, C4, … 3ـ قرائت جذب محلولهاي استاندارد As1, As2, As3, As4, … 4ـ رسم جذب برحسب غلظتهاي استاندارد و بدست آوردن نمودار كاليبراسيون

13. A=bc Ax y = ax + b A = ac + b A C Cx 5ـ اندازه‌گيري جذب محلول مجهول و بدست آوردن غلظت مجهول از روي نمودار كاليبراسيون Cx Ax

14. - در عمل ابتدا محلول بلانك در سل قرار داده شدهشكاف منبع تابش بسته شده 100% جذب يا صفر درصد عبور تنظيم مي‌شود - سپس شكاف منبع تابش باز شده 100% عبور يا صفر درصد جذب تنظيم مي‌شود - بعد از تنظيم صفر و 100جذب محلولهاي استاندارد و مجهول اندازه‌گيري مي‌شود. اين عمل در دستگاهها توسط Auto zero يا Baseline مي‌گردد.

15. عوامل انحراف از قانون Beer-Lambert(A = bC) 1ـ انحرافهاي شيميايي تفكيك، پليمري شدن, تجمع، تشكيل كمپلكسهاي مختلف، حلال‌پوشي ترکيبات مورد اندازه گيري، تغييرpHمحيط و... 2ـ انحرافهاي فيزيكي تغيير رنگ برخي از مواد متناسب با تغيير غلظت، تفاوت ضريب شکست (n)در محلولهاي رقيق و غليظ

16. 3ـ انحرافهاي دستگاهي تكفام نبودن تابش، آلودگي سلها، خطي نبودن جريان حاصل در دتکتور(فتوسل) با شدت نورتابشي، تغيير در مقدار الكتريسيته و درجه حرارت.

17. Source Analyzer Cell Detector Recorder شماي دستگاه اسپكتروفتومتر 1- منبع تابش: نور سفيد Io 2- محل نمونه: نمونۀ‌ گازي، جامد، مايع 3- تجزيه‌گر: منشور، يا شبكه 4- آشكارساز:PMT 5- ثبات:Chart

18. قسمتهاي مختلف دستگاه اسپكتروفتومتر 1- منابع تابش معمولي در اسپكتروفتومتري - لامپ تنگستن براي ناحيه مرئي 340-1000nm (Visible) - لامپ دتريوم براي ناحيه ماورا بنفش (Uv)190-370nm 2- منوكروماتور - منشور prism - شبكه grating 3- سل يا محل نمونه - شيشه و پلاستيك براي ناحيه مرئي - كوارتز براي ناحيه ماورابنفش

19. 4- آشكارساز - فتوتيوب - فتومالتي پلاير (PMT) 5- ثبات - نشانگرهاي عقربه دار - نشانگرهاي ديجيتالي ـ مانيتور

21. اسپكتروفتومترهاي مرئي و فرابنفش رايجترين ، نوع آنها در مراكز تشخيصي و آزمايشگاهي است اسپكتروفتومترها بر اساس تعداد پرتوهاي نوري كه به آشكارساز دستگاه مي رسد به دو نوع تك پرتويي و دوپرتويي تقسيم ميشوند.در نوع تك پرتويي يك جايگاه براي محلول و بلانگ وجود دارد در دستگاههاي دو پرتويي دو جايگاه منظور شده است .پرتوتابش شده بطور خودكار مجزا شده و ازمحلول بلانك و نمونه همزمان عبور مي كند اين دستگاهها بسيار حساس مي باشند.

22. قسمتهاي مختلف يك اسپكتروفتومتر شامل: 1ـ منبع نور(Light Source) 2ـ تك رنگ ساز(Monochromator) 3ـ شكاف عبور يا متمركز كننده پرتو(Focusing Device) 4ـ كووت يا محل قرار دادن نمونه (Cuvet) 5ـ دتكتوريا آشكار ساز (Detector) 6ـ صفحه نمايشگر (Display device)

24. منبع نور(Light Source) معمولا“از لامپهاي تنگستني كه توليد نور با طول موج990-300 نانومتر مينمايند استفاده مي شود براي توليد پرتوهاي فرابنفش غالبا“ از از لامپ هاي هيدروژني يا دوتريومي (با طول موج 450-200نانومتر) استفاده مي شود لامپ هاي دوتريومي معمولا“ پايدارترند وطول عمر بيشتري دارند.

25. تك رنگ ساز(Monochromator) اين قسمت دستگاه، نور مخلوط را به پرتوهاي تك رنگ تجزيه مي كند اين عمل در اسكپتوفتومتر معمولا“ توسط منشور يا سيستم گريتينگ(Grating) انجام مي گيرد شكاف عبور يا متمركز كننده پرتو(Focusing Device) تركيبي از عدسي ها،آئينه هاي كوچك مي باشد كه فقط به طيف رنگي با طول موج مورد نظر اجازه عبور مي دهند هر قدر عرض شكاف نور كمتر باشد كيفيت پرتوها بهتر خواهد بود. ميزان منوكروماتيك بودن نور تابيده شده به كووت بسيار مهم مي باشد كه با (Spectral Band Width) SBW پهناي باند طيف برحسب نانومتر مشخص مي شود هرچقدر عدد SBW كوچكتر باشد كيفيت دستگاه بهتر خواهد بود كه بستگي به نوع گريتينگ و پهناي شكاف عبور نور دارد. بهترين SBW براي اسپكتروفتومتر هاي آزمايشگاهي 8 نانومتر و براي دستگاههاي تحقيقاتي 4-8/1نانومتر مي باشد

26. كووت يا محل قرار دادن نمونه (Cuvet) كووتها محفظه هاي شفافي هستند كه محلول موردآزمايش در آن ريخته شده و در جايگاه خاص خود كه در مسير نور تكرنگ تعبيه شده است قرار مي گيرد. كووتها با توجه به نوع مصرف جنس ، شكل و حجم متفاوتي دارند. براي محلولهاي اسيدي و قليايي از كووتهاي مخصوص شيشه اي و براي طول موجهاي زير 320نانومتر از لوله كوارتز يا پلاستيك استفاده مي شود

27. دتكتوريا آشكار ساز (Detector) دتكتور يا آشكار ساز انرژي نوراني (عبور كرده از محلول را) به انرژي الكتريكي تبديل و آن را تقويت مي كند. آشكار سازها معمولا“ به سه گروه تقسيم مي شوند. 1- فتوالكتريكي 2- فتوشيميايي 3- حرارتي در اسكتروفتومتر از آشكار سازهاي فتوالكتريكي استفاده مي شود . فتوسل و فتوتيوب از جمله انهاست

28. صفحه نمايشگر (Display device) داده هاي بدست آمده از يك آشكار ساز بوسيله يك دستگاه بازخواني مانند يك گالوانومتر يا اسلوسكپ نشان داده مي شود انواع مختلف نمايشگر در اشكال عقربه اي، ديجيتالي و كامپيوتري در اسپكتروفتومترها وجود دارد

29. كووت يا محل قرار دادن نمونه (Cuvet) كووتها محفظه هاي شفافي هستند كه محلول موردآزمايش در آن ريخته شده و در جايگاه خاص خود كه در مسير نور تكرنگ تعبيه شده است قرار مي گيرد. كووتها با توجه به نوع مصرف جنس ، شكل و حجم متفاوتي دارند. براي محلولهاي اسيدي و قليايي از كووتهاي مخصوص شيشه اي و براي طول موجهاي زير 320نانومتر از لوله كوارتز يا پلاستيك استفاده مي شود

30. دتكتوريا آشكار ساز (Detector) دتكتور يا آشكار ساز انرژي نوراني (عبور كرده از محلول را) به انرژي الكتريكي تبديل و آن را تقويت مي كند. آشكار سازها معمولا“ به سه گروه تقسيم مي شوند. 1- فتوالكتريكي 2- فتوشيميايي 3- حرارتي در اسكتروفتومتر از آشكار سازهاي فتوالكتريكي استفاده مي شود . فتوسل و فتوتيوب از جمله انهاست

31. صفحه نمايشگر (Display device) داده هاي بدست آمده از يك آشكار ساز بوسيله يك دستگاه بازخواني مانند يك گالوانومتر يا اسلوسكپ نشان داده مي شود انواع مختلف نمايشگر در اشكال عقربه اي، ديجيتالي و كامپيوتري در اسپكتروفتومترها وجود دارد

32. كار با اسپكتروفتومتر 1- پس اتصال به برق دستگاه را روشن مي كنيم حدود 10 دقيقه صبر مي كنيم تا به اصطلاح دستگاه گرم شود 2- طول موج مورد نظر را انتخاب مي كنيم 3- با استفاده بلانك دستگاه را صفر ميكنيم 4-استانداردآزمايش و نمونه به ترتيب به كووت منتقل نموده و OD آن را مي خوانيم 5- با يك محاسبه غلظت نمونه بدست مي آوريم A=ODt/ODs X S

33. Dispersion of polychromatic light with a prism Infrared monochromatic Ray Red Orange SLIT Yellow Polychromatic Green PRISM Ray Blue Violet Ultraviolet Polychromatic Ray Monochromatic Ray Prism - spray out the spectrum and choose the certain wavelength (l) that you want by moving the slit. Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

34. Photomultiplier Tube Detector • High sensitivity at • low light levels • Cathode material • determines spectral sensitivity • Good signal/noise • Shock sensitive Anode Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

35. The Photodiode Detector • Wide dynamic range • Very good • signal/noise at high light levels • Solid-state device Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

36. Conventional Spectrophotometer Schematic of a conventional single-beam spectrophotometer Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

37. Conventional Spectrophotometer Optical system of a double-beam spectrophotometer Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

38. Conventional Spectrophotometer Optical system of a split-beam spectrophotometer Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

39. Cells UV Spectrophotometer Quartz (crystalline silica)  Visible Spectrophotometer Glass  IR Spectrophotometer NaCl Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

40. Cell Types I Open-topped rectangular standard cell (a) and apertured cell (b) for limited sample volume Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

41. Cell Types II Micro cell (a) for very small volumes and flow-through cell (b) for automated applications Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

42. SPECTROMETRIC ANALYSIS USING STANDARD CURVE Avoid very high or low absorbencies when drawing a standard curve. The best results are obtained with 0.1 < A < 1. Plot the Absorbance vs. Concentration to get a straight line Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

43. Relating Absorbance and Transmittance Absorbance rises linearly with concentration. Absorbance is measured in units. Transmittance decreases in a non-linear fashion. Transmittance is measured as a %. Absorbance = log10 (100/% transmittance) Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

44. Precision and Accuracy Precision – Precision + Precision – Precision + Accuracy – Accuracy – Accuracy + Accuracy + Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy

45. Thanks for your kind attention Fundamentals of modern UV-visible spectroscopy