第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备

1. 第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备

2. 第一节 杂交瘤技术的基本原理

3. 抗体种类 第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)

4. 淋巴细胞 。

5. 淋巴细胞发育 。

6. 浆细胞 。

7. 抗原接种 。

8. 动 物 BALB/c小鼠 7~12周龄 20~25g体重

9. 单克隆抗体 B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体

10. 杂交瘤技术原理 • 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 • HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系 • 单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体

11. 流 程

12. 培 养 液 • RPM1640培养液 • DMEM培养液

13. 细胞融合剂 • PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 • 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 • 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同

14. HGPRT酶与TK酶 • 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 • 胸腺嘧啶核苷激酶

15. HAT培养基 • H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 • A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 • T (Thymidine)：胸腺嘧啶核苷； “核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA

16. 应 用 液 • 8-杂氮鸟嘌呤 • 聚乙二醇

17. 骨髓瘤细胞系的选择 • 不产生Ig的重链和轻链 • HGPRT-;TK- • 与提供淋巴细胞的动物品系相同

18. 骨髓瘤细胞、淋巴细胞与杂交瘤细胞 • SP2/O: HGPRT- ，TK-;　长命 • 淋巴细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) • 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命

19. HAT选择作用 • 淋巴细胞：不能生长，5-7天死亡； DNA合成的主要途径被A阻断 • 骨髓瘤细胞：不能生长，5-7天死亡； HGPRT缺乏， DNA合成的替代途径受阻

20. 杂交瘤细胞 • 长期生长繁殖。 • 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA， • 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 • 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力

21. 克隆化 • 有限稀释法 • 显微操作法 • FACS法 • 半固体琼脂糖法

22. 有限稀释法 特点： • 不需任何特殊设备 • 克隆出现效率高 • 实验室常用方法 方法： • 细胞悬液通过系列稀释 • 每个培养孔含0.5～1个细胞

23. FACS 效率最高 价格昂贵

24. 杂交瘤细胞的冻存与复苏 • 配制方案：杂交瘤细胞（1～5x106/ml) + 细胞冻存液(30%-40% 牛血清，50%-60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) • “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 • “快融”：取出立即浸入37℃-40℃水浴中，使其迅速融化、复苏

25. 细胞冷冻的意义 • 防止污染 • 避免染色体丢失 • 防止非分泌细胞的过度生长 • 防止细胞密度过高而死亡

26. 第二节 单克隆抗体制备

27. 培养骨髓瘤细胞 • 选择对数生长期的细胞进行传代培养 • 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 • 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 • 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中

28. 免疫脾细胞的制备 • 1×108淋巴细胞 • 无菌手术

29. 采取饲养细胞 • 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 • 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 • 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 • 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化

30. 饲养细胞 。

31. 融合方法 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完; 2min内加10ml培养液

32. 细胞融合 • SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2-5 • 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用 • 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为0.5-1.5×105个。融合后7天，换用HT培养液。

33. 融合细胞的早期培养 10~20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆

34. 筛选常用方法 • 可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 • 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）

35. ELISA

36. ELISA

37. 多头加样枪

38. 免疫荧光法 。

39. 生产单克隆抗体 • 体外培养 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除 • 动物接种 每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10 ╳105/只

40. 免疫小鼠 • 细胞性抗原：1-2 × 107/只，不加佐剂，2-3周重复一次 • 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3-6周 • 100-200微克抗原，融合前3天，加强免疫

41. 腹腔注射法

42. 高滴度腹水 • 前5天进行,预先腹腔注射pristane • 1~5×106细胞 • 1~3w形成腹水

43. McAb的纯化 • 盐析沉淀 • 亲和层析 • 离子交换层析

44. McAb的鉴定 • Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 • 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 • 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 • 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞争抑制法，相加指数法及微机集群分析 • 亲和性测定：测定亲和常数K • 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 • McAb靶抗原分子量：常用western blot

45. McAb与PcAb的比较 McAbPcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高 得量 高 低 特异性 高 低 　　 稳定 　　低 高 沉淀反应 无 有 成本 高 低

46. McAb and PcAb

47. 第三节 基因工程抗体

48. 基因工程抗体Genetic engineering antibody 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。

49. 人源化抗体 • 将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体 • 将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体

50. 嵌合抗体 chimeric antibody • 方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体 • 特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力