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CROMATOGRAFÍA

CROMATOGRAFÍA. Mikhail Tswett, 1906 Separación de pigmentos vegetales usando una columna de carbonato cálcico. Separación de los componentes de una mezcla ( muestra ), disueltos en una fase móvil a medida que se van desplazando con diferente velocidad a través de una fase estacionaria.

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CROMATOGRAFÍA

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Presentation Transcript

  1. CROMATOGRAFÍA Mikhail Tswett, 1906Separación de pigmentos vegetales usando una columna de carbonato cálcico

  2. Separación de los componentes de una mezcla (muestra), disueltos en una fase móvil a medida que se van desplazando con diferente velocidad a través de una fase estacionaria CROMATOGRAFÍA

  3. ESTADO FÍSICO DE LAS FASES:Fase Móvil - Gaseosa (Cromatografía de gases) - Líquida (Cromatografía Líquida)Fase Estacionaria - Líquida (inmovilizada, soporte) - Sólida TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

  4. CRITERIOS DE SEPARACIÓN:1. REPARTO (F. estacionaria “líquida”)Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases móvil y estacionaria en función de sus características. La composición de la fase móvil es constante.2. ADSORCIÓN (F. estacionaria sólida)Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la composición de la fase móvil para eluirlos. TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

  5. SOLUBILIDAD Fase “Normal”: F. Estacionaria polar, F. Móvil apolar Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Móvil polar2. TAMAÑO (exclusión molecular) Fases móvil y estacionaria líquidas idénticas separadas por una especie de tamiz o malla CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

  6. INTERCAMBIO IÓNICO Fase estacionaria positiva: Intercambio aniónico Fase estacionaria negativa: Intercambio catiónico2. INTERACCIÓN HIDROFÓBICA Fase estacionaria hidrofóbica3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD BIOLÓGICA Fase estacionaria con ligandos inmovilizados4. ADSORCIÓN INESPECÍFICA hidroxiapatita, colorantes inmovilizados CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

  7. TIPOS DE CROMATOGRAFíA

  8. FORMATO 1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados (HPLC) 2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS - Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

  9. TERMINOLOGÍA • FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico) componente estático de la cromatografía • FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la columna los componentes de la mezcla a analizar • ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta lograr la salida de los solutos • ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna

  10. TERMINOLOGÍA • CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de elución. Representación gráfica de la cuantificación de solutos en el eluído de una columna • VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa a través de la columna hasta que sale cada soluto • VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una molécula que viaja a través de la columna con la velocidad de la fase móvil, que no experimenta ningún retraso. También se llama VOLUMEN DE EXCLUSIÓN

  11. Detector (UV) CROMATOGRAFIA EN COLUMNA Bomba(s) Registrador Solventes (fase móvil) COLUMNA Mezclador Inyector Colector de fracciones

  12. HPLC:High Performance Liquid Chromatography

  13. Waters, Millipore

  14. Perceptive BioSystems, BioCAD

  15. SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE HPLC

  16. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA(manual)

  17. SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES POR ULTRACENTRIFUGACIÓN

  18. ELIMINACIÓN DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS MEDIANTE DIÁLISIS

  19. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

  20. Volumen de líquido en los intersticios (Vo) VT = Vo+ Vi + Vg 2.0 Volumen total de líquido (Vt) Volumen de líquido en las partículas (Vi) Absorbancia (280 nm) Volumen ocupado por la matriz (Vg) 0.0 120 100 80 60 40 20 Volumen de elución (ml) CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR Flujo isocrático, condiciones nativas o desnaturalizantes

  21. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR Nombre comercial Tipo de matriz Rango tamaño Sephadex G-50 dextran 1500 - 30000 Sephadex G-100 dextran 4000 - 150000 Sephacryl S-200 HR dextran 5000 - 250000 Ultrogel AcA 54 polyacrylamide/agarose 6000 - 70000 Ultrogel AcA 44 polyacrylamide/agarose 12000 - 130000 Ultrogel AcA 34 polyacrylamide/agarose 20000 - 400000 Bio-Gel P-60 polyacrylamide 3000 - 60000 Bio Gel P-150 polyacrylamide 15000 - 150000 Bio-Gel P-300 polyacrylamide 60000 - 400000

  22. 2.0 A280 nm 0.0 120 100 80 20 40 60 2.0 A280 nm 0.0 120 100 80 20 40 60 Volumen de elución (ml) CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:Estimación de masas moleculares Marcadores de masa molecular Recta de calibrado 25 kD 67 kD 14 kD 43 kD Volumen de elución (ml) Proteína problema Log Mr

  23. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR • VENTAJAS: • Flexibilidad en cuanto a solvente • Condiciones poco agresivas • Proporciona información estructural • INCONVENIENTES: • Poco resolutiva, debido a difusión • La muestra se diluye • Es necesario aplicar volúmenes muy pequeños • Etapas finales de protocolos de purificación

  24. 2.0 0.3 kD 120 kD 0.0 1.2 1. 0.8 0.2 0.4 0.6 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:Columnas de “desalado” Volumen de elución (ml) • Cambio de solvente • Purificación de fragmentos de DNA marcados • (fragmento 200 pb: 120 kD; nucleótidos libres: aprox. 0.3 kD

  25. INTERCAMBIO IÓNICO

  26. INTERCAMBIADORES IÓNICOS FASE ESTACIONARIA: SOPORTE – GRUPO CARGADO SOPORTES: • RESINAS SINTÉTICAS. (P.ej. Poliestireno) • - Densidad muy alta de grupos • intercambiadores • - Muy hidrofóbicas: desnaturalización • de biomoléculas • - Eliminación de impurezas iónicas de • solventes químicos y de tampones • Purificación de agua • POLÍMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa

  27. INTERCAMBIADORES IÓNICOS

  28. INTERCAMBIADORES IÓNICOS CH2CH3 + -CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3 CH2CH3 CH2CH3 + -CH2CH2-N-H CH2CH3 - -CH2CH2-CH2-SO3 - -CH2-COO3

  29. INTERCAMBIADORES IÓNICOS + aniónico débil (DEAE) aniónico fuerte (QAE) carga pH catiónico fuerte (SP) catiónico débil (CM) -

  30. Matriz(-). Ión(+) + Soluto(+) Matriz(-) . Soluto(+) + Ión(+) [Matriz(-) . Soluto(+)][Ión(+)] K= [Matriz(-) . Ión(+)][Soluto(+)] INTERCAMBIO IÓNICO

  31. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO • Equilibrado. Ajuste a condiciones iniciales • Adsorción. Baja fuerza iónica. Intercambio aniónico, pH >pI Intercambio catiónico, pH < pI • Lavado. Condiciones iguales a la adsorción. • Elución. Modificación de la fase móvil: aumento de fuerza iónica + pH pI -

  32. INTERCAMBIO IÓNICOGRADIENTE DISCONTINUO 0.5 2.0 [NaCl] (M) - - - - Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 120 100 80 60 40 20 Número de fracción

  33. INTERCAMBIO IÓNICOGRADIENTE LINEAL 0.5 2.0 [NaCl] (M) - - - - Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 120 100 80 60 40 20 Número de fracción

  34. CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA 1.0 2.0 [Sal] (M) - - -- Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 120 100 80 60 40 20 Fenil-sefarosaOctil-sefarosa Número de fracción

  35. CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA Capacidad de facilitar interacciones hidrofóbicas (PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN- (NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+

  36. FORMATO 1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados (HPLC) 2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS - Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

  37. CROMATOGRAFÍA SOBRE SUPERFICIES PLANAS - Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

  38. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL - Fase estacionaria: H2O retenida entre las fibras de celulosa del papel - Fase móvil: Solvente orgánico (mezcla) Cromatografía de reparto, fase normal

  39. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL • Aplicación de la muestra: volumen mínimo • Desarrollo de la cromatografía: Extremo sumergido en la fase móvil, sin tocar el punto de aplicación de la muestra. Recipiente cerrado herméticamente. Ascendente/descendente • Detección de las sustancias separadas: • Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes) • Tinción • Autorradiografía (compuestos radiactivos)

  40. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA • Optimización de cromatografía en papel • Fase estacionaria: fina capa (0.15-0.5 mm) de sólido pulverizado sobre una superficie de vidrio, plástico o cristal. • Celulosa, poliamida, alúmina, sílica-gel

  41. VENTAJAS DE LA TLC

  42. MÉTODOS DE TINCIÓN EN TLC

  43. FACTOR DE RETARDO (Rf) Frente del solvente soluto Distancia migrada por el soluto Rf = Distancia migrada por el frente origen

  44. TLC BIDIMENSIONAL 2ª dimensión 1ª dimensión punto de aplicación

  45. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD + glucose

  46. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD 2.0 • Equilibrado. Ajuste a condiciones iniciales. • Adsorción. Alta fuerza iónica. • Lavado. Condiciones iguales a la adsorción. • Elución. • Competición con ligando libre • Desnaturalización (pH, temperatura, agentes caotrópicos) Adición de ligando libre Absorbancia (280 nm) 0.0 100 80 60 40 20 Número de fracción

  47. LIGANDOS PARA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

  48. NH = O-C-NH-ligando agarosa agarosa C=N OH CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: PREPARACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA • Activación del soporte • Anclaje covalente del ligando • Bloqueo de grupos reactivos remanentes OH + NH2-ligando O agarosa + CNBr OH O

  49. PROTEÍNAS DE FUSIÓN RECOMBINANTES

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