Физическая химия биополимеров Лаврик О.И.

1. Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012

2. 6. Многосубстратные ферментативные реакции. Уравнения, описывающие эти реакции. Определение параметров в стационарном режиме. Порядок присоединения субстратов. Методы его определения

3. Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами Двусубстратная Односубстратная реакция реакция S1>>S2 Должен быть известен порядок присоединения субстратов

4. Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами 1. Последовательное связывание субстратов с образованием тройного комплекса:

5. Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами Для схемы с последовательным связыванием субстратов уравнение скорости реакции: v=k3[ES1S2] Для нахождения [ES1S2] в систему уравнений добавляется уравнение материального баланса и условия квазистационарности: E0 = [E] + [ES1] + [ES1S2]

6. Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами DE = k-1k-2+k2S2k3+k-1k3 ; ; DES1 = k1S1k3+k1S1k-2 DES1S2 = k1S1k2S2

7. v = = Для определения параметров реакции из экспериментальных данных это уравнение можно линеаризовать : =

8. Определение величин коэффициентов φi Накопление продукта реакции во времени при различных концентрациях S1 и S2=const, или наоборот, при различных концентрациях S2 и S1=const.

9. Определение величин коэффициентов φi a=φ0+φ2/S2b=φ1+φ12/S2

10. Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами 2. Произвольныйпорядок присоединения двух субстратов в процессе образования тройного комплекса: v = где DES1S2 – определитель узла графа, в котором происходит образование продуктов реакции.

11. Методы определения порядка присоединения субстратов Гель-фильтрация. Метод задержки в геле (gel retardation, или electrophoretic mobility shift assay – EMSA). Тушение флуоресценции. Можно следить за изменением интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Trp) в белковой молекуле фермента, происходящим при комплексообразовании. Интенсивность флуоресценции при образовании комплекса с ферментом может изменяться и для субстрата. В этом случае можно использовать аналог субстрата, имеющий флуоресцентную метку.

12. Использование аналогов субстратов для определения порядка присоединения субстратов Аналоги субстратов выбираются таким образом, чтобы они продолжали быть субстратами, то есть участвовали в каталитических стадиях ферментативного процесса. В случае аналога субстрата кинетические характеристики ферментативной реакции (KM, kcat) могут измениться, для тех стадий, в которых принимает участие данный субстрат (его аналоги).

13. Определение порядка присоединения субстратов Для исследования порядка присоединения субстратов в реакции аминоацилирования, катализируемой аминоацил-тРНК-синтетазами, были использованы фторированные аналоги аминокислот, например: Пара-фторфенилаланин Фенилаланин

14. Метод конкурентных ингибиторов Реакция аминоацилирования тРНК с образованием фенилаланил-тРНК, катализируемая фенилаланил-тРНК-синтетазой): E + АТР + Phe Е-Phe-АМР + ррi Е-Phe-АМР + тРНКPheЕ + Phe-тРНКPhe + АМР

15. Метод конкурентных ингибиторов Аминогруппа – при ее замене сродство субстрата к ферменту резко падает Фенильная группа участвует в узнавании субстрата. Фенилаланинол (Phe-ol) – конкурентный ингибитор фенилаланина в реакции аминоацилирования. Kd (Phe)=10-6M Kd (Phe-ol)=10-5M ФенилаланинФенилаланинол

16. Метод конкурентных ингибиторов • Ингибитор образует • комплекс с ферментом 2.Ингибитор образует тройной комплекс ES1I Для установления порядка присоединения субстратов нужно решить уравнения для схем 1 и 2, с помощью метода графов.