Лекция 3

1. Генетический анализ Лекция 3

2. Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они предварительно уже решены другими. Поэтому необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает к генетическому анализу, от уныния и пессимизма, если их первые попытки окажутся неудачными. Александр Сергеевич Серебровский

3. Вопросы • Анализ наследования отдельных признаков у низших эукариот. • Анализ случайной выборки спор. • Тетрадный анализ. • Анализ совместного наследования признаков у грибов-аскомицетов: • Тетрадный анализ независимого наследования. • Тетрадный анализ сцепленного наследования. Картирование генов и центромеры.

4. Наследование отдельных признаков у низших эукариот

5. Типы тетрад и октад у грибов-аскомицетов Неупорядоченные (нелинейные) тетрады Упорядоченные (линейные) тетрады Sacharomyces cerevisiae Aspergillus nidulans Neurospora crassa У грибов-аскомицетов аскоспоры находятся в одной сумке – аске. Их может быть 4, или если после мейоза сразу происходит митоз – 8. Генетический анализ у низших эукариот проводится либо на случайной выборке спор, либо методом тетрадного анализа, либо путем учета митотических расщеплений. Единицей учета при анализе служат клоны или штаммы – генетически однородные культуры клеток, получаемые при бесполом размножении клеток, содержащих одно ядро.

6. Анализ случайной выборки спор

7. Анализ случайной выборки спор Для количественного учета мейотических расщеплений на случайной выборке спор в моногибридном скрещивании выделяют гаплоидные продукты мейоза (аскоспоры) в потомстве гибрида, полученного от скрещивания штаммов, различающихся по одному признаку (размер или форма колоний, окраска колоний, ауксотрофность, устойчивость и т.д.). Для этого собирают споры, не загрязненные вегетативными гибридными клетками и клетками родительских форм. Метод отпечатков (реплик), полноценная, минимальная и селективная среды. Если родительские формы различаются по аллелям одного гена (B и b), то гетерозигота после мейоза образует два типа спор в равном количестве, и соотношение мутантных и нормальных колоний, выращенных из случайной выборки спор должен быть в этом случае примерно как 1:1. Если признак контролируется не одним, а большим числом генов, то наблюдается отклонение от этого расщепления, например 3:1. Если в потомстве аскоспор гибрида расщепление отсутствует, то можно предположить, что признак определяется цитоплазматическим фактором. Расщепления на случайной выборке аскоспор не отличаются от расщепления у высших эукариот в анализирующем скрещивании.

8. Тетрадный анализ

9. Тетрадный анализ Тетрадный анализ – комплекс методов, направленных на определение генотипа особи по генотипу микроспор тетрады или четырех гамет, образованных в результате гаметического расщепления в процессе мейоза. Тетрадный анализ используется при изучении организмов, образующих стабильные, но в последствие распадающиеся тетрады (водоросли, грибы). Поскольку аскоспоры в аске некоторое время сохраняются вместе, можно учесть расщепление в каждой четверке спор, образовавшихся после одного мейоза (или четырех парах спор, если аски восьмиспоровые). Разделение, проращивание спор и анализ. Если происходит расщепление по одной аллельной паре (B и b), то соотношение аскоспор во всех асках должно быть 2B:2b (или 4B:4b, если аски восьмиядерные), что служит прямым доказательством закона чистоты гамет. В тетрадном анализе не сокращают коэффициенты, т.е. не пишут 1B:1b, (такая запись означает, что из 4 (или 8) аскоспор проросло только 2). 1 2 3 4 ТЕТРАДЫ I II III IV V VI I II III IV V VI наличие роста отсутствие роста

10. Тетрадный анализ Отклонения в расщеплении при моногенном контроле редки и могут быть связаны с конверсией гена. Появление значительного количества тетрад, имеющих отклонение от расщепления 2:2 по изучаемому признаку, например 4:0,3:1, свидетельствует об участии в расщеплении более одного гена. Другие причины отклонений – хромосомные перестройки, анеуплоидия и др., которые снижают жизнеспособность аскоспор и тем самым влияют на расщепление. Важная особенность тетрадного анализа – возможность картирования центромеры, которая выступает в качестве генетического маркера. В упорядоченных тетрадах картирование центромеры можно сделать на основе расщепления по одному гену, анализируя порядок расположения спор разного генотипа (А и а) в аске. В неупорядоченных тетрадах картирование центромеры можно сделать на основе расщепления по трем генам, анализируя порядок расположения спор разного генотипа в аске. Возможны два типа расхождения хромосом в мейозе, которые определяют порядок расположения спор в аске: расхождение в первом делении мейоза (рIд) и во время второго деления мейоза (рIIд). Если в мейозе в гетерозиготной клетке не происходит кроссинговер между геном и центромерой, то расхождение аллелей идет в первом делении мейоза (рIд), если происходит - во втором делении мейоза (рIIд).

11. Тетрадный анализ a отсутствие кроссинговера a a a 1 2 3 4 a a a a a Аскоспоры в аске a A A A A A A A A A A коньюгация (профаза I) после I деления после II деления Расхождение аллелей в первом делении мейоза у нейроспоры. Порядок расположения спор в аске aaaaAAAA/AAAAaaaaзависит от ориентации хромосом бивалента в метафазе I деления. после митоза наличие кроссинговера a a a a 1 2 3 4 a A A A A Аскоспоры в аске a A a a a a A A A A A коньюгация,кроссинговер в биваленте (профаза I) после I деления после II деления Расхождение аллелей во втором делении мейоза у нейроспоры. Порядок расположения спор в аске определяется ориентацией хромосом бивалента в метафазе I деления и ориентацией хроматид в метафазе II деления. Может иметь 4 варианта: aaAAaaAA/AAaaAAaa/aaAAAAaa/AAaaaaAA. после митоза

12. Тетрадный анализ • Общие выводы: • порядок расположения спор в асках нейроспоры позволяет выявить, в каких из них произошел кроссинговер между геном и центромерой, и вычислить, расстояние между ними. • для определения частоты кроссинговера необходимо подсчитать число асков, в которых он произошел (рIIд), и определить их долю среди всех проанализированных асков. Так как в кроссоверном аске только половина спор является кроссоверными, расстояние между геном и центромерой определяют как ½ от доли кроссоверных асков. В скрещивании между штаммом нейроспоры, продуцирующим черные споры, со штаммом, дающим споры рыжего цвета в поколении гетерозиготы обнаружены аски со следующим расположением спор (всего 146): Соотношения спор разной окраски в каждом аске – 4:4, следовательно различия обусловлены аллелями одного гена. Порядок расположения спор в 26 асках свидетельствует о расхождении аллелей во втором делении, т.е. о прошедшем кроссинговере между геном и центромерой. Доля кр.асков=17,8%; расстояние 8,9.

13. Анализ совместного наследования признаков у грибов-аскомицетов

14. Анализ совместного наследования признаков у грибов-аскомицетов • При изучении совместного наследования признаков у грибов аскомицетов используют либо анализ случайной выборки спор, либо метод тетрадного анализа. При использовании обоих методов оценивают тип тетрад. Расщепление (соотношение) разных типов тетрад, по двум и более генам определяется: • локализацией генов в одной или разных группах сцепления; • расстоянием генов от своих центромер. • Различают • тетрадный анализ независимого наследования признаков; • тетрадный анализ сцепленного наследования признаков

15. ab AB AB Ab Ab aB aB ab Тетрадный анализ независимого наследования При независимом наследовании у аскомицетов с упорядоченными тетрадами (октадами) по каждому гену образуется 6 типов тетрад: ген A -AAaa, aaAA, AaAa, aAaA, AaaA, aAAa;ген B - BBbb, bbBB, BbBb, bBbB, BbbB, bBBb; образование равновероятностное при отсутствии сцепления с центромерой (более 33%). При этом образуется три типа тетрад с разным сочетанием генов A и B: (I) P – родительский дитип: AB, AB, ab, ab; (II) N – неродительский дитип: Ab, Ab, aB, aB; (III) T – тетратип, содержит 4 разных генотипа: AB, Ab, aB, ab. T-тип тетрад возникает только при кроссинговере между генами и их центромерами. Тип тетрад A B P A B a b a b отсутствие кроссинговера A b N A b a B a B

16. AB ab AB Ab aB ab aB AB Ab ab aB Ab AB ab Ab aB Тетрадный анализ независимого наследования Тип тетрад A B A B T A B a B a b A b a b a b A B A B T A B A b a b a B a b a b кроссинговермежду одним геном и его центромерой a B a B T a B A B A b a b A b A b a b a b T a b a B A B A b A B A B

17. Тетрадный анализ независимого наследования Образование разных типов тетрад при независимом наследовании и отсутствии сцепления между генами и их центромерами в дигибридном скрещивании AB x ab Соотношение тетрад разного типа при независимом наследовании и отсутствии сцепления генов с центромерами составляет 6P: 6N: 24T или 1P: 1N: 4T. Соответственно частоты возникновения тетрад каждого типа будут составлять f(P)=f(N)=1/6=0,167 или 16,7%; f(T)=4/6=0,667 или 66,7%;

18. Тетрадный анализ независимого наследования • Ход анализа. • Из аска по порядку извлечь споры. • Прорастить их на питательных средах (полноценной, минимальной, селективных). • Определить фенотипические проявления признака. • Определить генотип анализируемого организма – генотип споры. • Определить тип тетрады. • Сформировать группы для асков с тетрадами определенного генотипа. • Определить соотношение асков с тетрадами разных типов (P, N, T). • Выдвинуть гипотезу о генотипах родительских организмах и характере наследования признаков. • Осуществить статистическую проверку соответствия выдвинутой гипотезы с полученными результатами. • Заказать пироженные и кофе или только кофе. В упорядоченных тетрадах генотип каждой споры и тип тетрады определяют по росту колоний, выросших из спор, извлеченных из аска по порядку, на полной, минимальной и селективной средах. Число селективных сред зависит от числа маркеров, используемых в скрещивании. Затем суммируют аски с одинаковым типом тетрад, определяют соотношение асков с тетрадами разных типов (P, N, T) и по X2проверяют соответствие опытного расщепления с теоретически ожидаемым – 1P: 1N: 4T. Применение метода X2 возможно лишь в том случае, когда количество проанализированных тетрад не менее 30.

19. AB ab ab AB AB ab ab AB Тетрадный анализ сцепленного наследования При сцеплении между генами нарушается соотношение разных типов тетрад, свойственное независимому наследованию: увеличивается доля тетрад (I) P – родительского дитипа (AB, AB, ab, ab) и уменьшаются доли (II) N – неродительского дитипа (Ab, Ab, aB, aB) и (III) T – тетратипа (AB, Ab, aB, ab). P-тип тетрад возникает при мейотическом делении в отсутствии кроссинговера и при наличии двойного кроссинговера на участке между генами с участием двух хроматид. отсутствие кроссинговера Тип тетрад A B P A B a b a b двойной кроссинговер на участке между генами с участием двух хроматид A B A B P A B A B a b a b a b a b

20. aB aB aB Ab Ab Ab aB AB AB ab Ab AB ab Ab ab aB Тетрадный анализ сцепленного наследования одиночный кроссинговер на участке между генами с участием двух хроматид Тип тетрад A B A B T A b A B a B a b a b a b двойной кроссинговер на участке между генами с участием трех хроматид A B A B A B T A b A b A B a B a b a b a b a B a b A B A b A B T A b A B A B a B a B a b a b a b a b двойной кроссинговер на участке между генами с участием четырех хроматид A b A b A B N A B A b A B a B a B a b a b a B a b

21. Тетрадный анализ сцепленного наследования • Закономерности и выводы: • при сцепленном наследовании резко уменьшается доля N-тетрад, так как они возникают только при двойном кроссинговере между генами с участием четырех хроматид; • доля T-тетрад зависит от расстояния между генами и от расстояния между каждым из них и центромерой; • Если частота P-тетрад больше , чем частота N-тетрад, а частота T-тетрад меньше чем ⅔, то это одназначно свидетельствует о сцеплении генов. • Так как N-тетрады содержат четыре, а T-тетрады только две кроссоверные хроматиды (споры), то расстояние между генами A и B (DAB) можно определить по частоте N- и T-тетрад: • DAB= f (N) + ½f(T), в % кроссинговера или сМ. • Так как наблюдаемая частота рекомбинантов не всегда равна истинной частоте произошедших обменов (в случае, когда гены расположены далеко друг от друга), так как множественные обмены по своим последствиям не отличаются от одиночных, а некоторые из них не проявляются фенотипически, вводят поправку. При этом для определения расстояния используют формулу: • DAB= -33,33ln(1-1,5f (T)), в стрейнах (Стертевант и Холдейн). • Если гены локализованы в разных хромосомах, но тесно сцеплены со своими центромерами, то f(P)=f(N), а f(T)<2/3,так как для появления T-тетрад необходимо прохождение кроссинговера между геном и центромерой. Чем ближе ген расположен к центромере, тем реже появляются T-тетрады. Следовательно, возникновение P и N тетрад при тесном сцеплении генов с центромерами не связано с кроссинговером, поэтому их соотношении остается равным 1:1.

22. Тетрадный анализ сцепленного наследования При скрещивании двух штаммов дрожжей, различающихся по трем генам (а) s, t, u X (A) +++ в потомстве гетерозигот, выращенных на соответствующих селективных средах, получили следующие результаты тетрадного анализа: Расщепление s-t: 59P:53N:88T, 1:1:4 x2=32,9 p<0,01. P=N, T< 2/3,-гены в разных хромосомах, -тесно сцеплены со своими центромерами. Расщепление s-u: 144P:56T, P>T, T< 2/3, N=0, -гены сцеплены Dsu= ½*56/200=14% Dsu= -33,33ln(1-1,5*56/200)=18.1% Расщепление t-u: 89P:79N:32T, P=N, T< 2/3, -гены в разных хромосомах, -тесно сцеплены со своими центромерами. Анализ Определяем тип тетрад и расщепление по каждой паре отдельно: Гены s и u локализованы в одной хромосоме на расстоянии 14 % кроссинговера. Ген t локализован в другой хромосоме и тесно сцеплен со своей центромерой.

23. Тетрадный анализ сцепленного наследования При скрещивании двух штаммов нейроспоры: дикого типа и ауксотрофа по аденину и триптофану (A) ++ X (a) ade try получили следующие результаты тетрадного анализа: Можно ли на основании приведенных данных картировать эти гены? Сказать все, что Вы думаете по этому поводу… • Задачи: • определить сцеплены ли гены; • если гены сцеплены, то определить их положение относительно центромеры, построить карту; • если гены не сцеплены, то локализовать их относительно их центромер (по возможности).

24. Тетрадный анализ сцепленного наследования При скрещивании двух штаммов нейроспоры: дикого типа и ауксотрофа по аденину и триптофану (A) ++ X (a) ade try получили следующие результаты тетрадного анализа: Анализ Определяем тип октад и их соотношение. 170P : 24N : 106T - Уменьшение доли N-октад по сравнению с P-октадами и появление T-октад в количестве меньшем чем 2/3 свидетельствует о сцеплении генов. Определяем расстояние между генами ade и try Процент кроссинговера между ними cоставляет: f(N) + ½f(T) = 24/300 + ½*106/300 = 0,257*100% = 25,7% ±2,5% Определяем тип октад и расщепление по каждому гену отдельно: Расщепление по гену ade: В 40 асках расхождение аллелей гена ade произошло во втором делении мейоза:ade+ade+ (23+8+2) и ade++ade (7) Соответственно расстояние между геном ade и центромерой составляет: ½ 40/300 = 0,066 * 100% = 6,6% Расщепление по гену try: В 123 асках расхождение аллелей гена try произошло во втором делении мейоза: try+try+ (91+23+7) и +try+try (2) Соответственно расстояние между геном try и центромерой составляет: ½ 123/300 = 0,205 * 100% = 20,5% На основании этих данных строим карту участка хромосомы, включающего центромеру, гены ade и try: 6,6 % 20,5 % ade try