1 / 54

Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal Laser Scanning Microscopy. dept. of Pathology, Ghent University. CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie. basic confocal fluorescent microscopy. CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006

early
Download Presentation

Confocal Laser Scanning Microscopy

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Confocal Laser Scanning Microscopy • dept. of Pathology, Ghent University Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  2. basic confocal fluorescent microscopy Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  3. Conventional widefield fluorescent microscope: • Fluorophores throughout the entire depth of the specimen are illuminated • Fluorescence signals are collected not only from the plane of focus but also from areas above and below •  Thick specimens: blurry, lack of contrast Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  4. Confocal fluorescent microscope: • Point light source: intense irradiation at the focal spot • Point detection: elimination of out-of-focus fluorescence •  Optical sectioning of thick specimens: sharp images Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  5. widefield versus point illumination Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  6. Benefits of CLSM: • Elimination of out-of-focus fluorescence • Areas above and below the focal spot: less intense irradiation • Series of optical sections at different depths: 3D reconstruction of the specimen Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  7. Benefits of CLSM: • Permits the direct study of living cells without damage • Improves lateral and axial resolution • Simultaneous detection • Electronic data acquisition Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  8. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  9. Elements of the confocal microscope: • Point light source (laser) • Scanning system (usually a laser-scanner) • Lens (condensor and objective) • Filters • Detector (PMT or CCD) Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  10. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  11. Applications: • Fluorescent-stained cells in tissue slices/small intact organisms • Localizing fluorescence-tagged molecules in dissociated cells • Monitoring fluorescence in living specimens (GFP) • Photobleach experiments (FRAP, FLIP) Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  12. Radiance 2100 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  13. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  14. System: Nikon Diaphot 300 • Inverted microscope • Lenses: 10x fluor, 40x fluor (oil), 60x plan apo (oil) • Hg lamp • Filter sets: DAPI, FITC, TRITC Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  15. System: 3 lasers • 4 line argon laser: 457, 476, 488, 514nm • Green HeNe laser: 543nm • Blue laser diode: 405nm • 2 channel confocal Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  16. System: dichroic mirrors • 100% det1 • 500DCLPXR • 560DCLPXR • 100% det2 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  17. System: PMT1 emission filter set Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  18. System: PMT2 emission filter set Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  19. System: implications for the choice of fluorophore • Lasers  absorption spectrum • Emission filters  emission spectrum • Fluorophore wall chart • BioRad interactive database at • http://fluorescence.bio-rad.com/frames6.htm Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  20. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  21. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  22. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  23. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  24. Software: Lasersharp 2000 • Instrument control panel • Objective • Box size • Speed • Channel Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  25. Software: Lasersharp 2000 • Control of the optical system set up • Laser • Dichroic mirror • Emission filter •  Method design (simultaneous/sequential) Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  26. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  27. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  28. Lasersharp 2000: image acquisition • Live scan/sequential live scan • Z-series collection • Vertical section • Line scan • Scan rotation and panning Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  29. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  30. Lasersharp 2000: analysis and processing functions • Arithmetic operations • Histogram • Line profile • Projection • Orthogonal view Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  31. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  32. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  33. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  34. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  35. Lasersharp 2000: region of interest scanning (ROI) • Fotobleaching experiments (FRAP, FRET, …) • Different shapes of ROIs • Different illumination levels • Multi-phase time course Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  36. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  37. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  38. Images Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  39. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  40. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  41. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  42. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  43. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  44. Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  45. monolayer culture of cervical cancer cells Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  46. monolayer of cervical cancer cells in coculture with PBMCs Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  47. monolayer of cervical cancer cells infected with fluorescent beads Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

  48. Survival and dispersion of transplanted BrdU/GFP positive aNPCs. Raedt et al 2008 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  49. in vivo differentiation towards GFAP positive astrocytes Raedt et al 2008 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

  50. In vivo differentiation towards NeuN positive neuronal cells Raedt et al 2008 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

More Related