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质粒 DNA 的提取 小麦黄化苗核 DNA 的提取 DNA 的鉴定——琼脂糖电泳 DNA 酶切 DNA 回收、连接 质粒转化大肠杆菌

质粒 DNA 的提取 小麦黄化苗核 DNA 的提取 DNA 的鉴定——琼脂糖电泳 DNA 酶切 DNA 回收、连接 质粒转化大肠杆菌. 质粒 DNA 的提取. 一、实验目的 学习质粒的相关基本知识 掌握碱裂解法提取质粒 DNA 的原理和方法. 二、 相关基本知识. 质粒( Plasmid) 是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200 kb 不等,为双链、闭环的 DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

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质粒 DNA 的提取 小麦黄化苗核 DNA 的提取 DNA 的鉴定——琼脂糖电泳 DNA 酶切 DNA 回收、连接 质粒转化大肠杆菌

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Presentation Transcript

  1. 质粒DNA的提取 • 小麦黄化苗核DNA的提取 • DNA的鉴定——琼脂糖电泳 • DNA酶切 • DNA回收、连接 • 质粒转化大肠杆菌

  2. 质粒DNA的提取 一、实验目的 学习质粒的相关基本知识 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法

  3. 二、相关基本知识 • 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。 • 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。 • 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。常见的天然质粒有F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒和Col质粒。

  4. 质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control) 松驰控制型(Relaxed control) 前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒,如 F 因子。 后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col质粒。

  5. 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。常用的质粒载体可以分为克隆载体和表达载体质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。常用的质粒载体可以分为克隆载体和表达载体 • 一个理想的质粒克隆载体应具有的特性: （1）分子量小； （2）多拷贝、松驰控制型； （3）具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS, multiple cloning sites)； （4）能插入较大的外源DNA片段； （5）具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、 a-互补显色反应（蓝白斑筛选） • 常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，克隆载体如:pGEM-T、pUC-mT和pBluescript（简称pBS）等 ，表达载体如:p1300质粒等

  6. pBluescript II

  7. 潮霉素

  8. 三、实验原理 碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。 在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然H键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。 当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。

  9. 三、实验材料、器具及药品 • 实验材料 • 　　含PUCm-T的E. coli DH5α菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管), 离心管架。 • 实验器具　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器。

  10. 实验药品 1.LB培养基配制及分装(每升用量) 胰蛋白胨(Bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(Bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g PH 7.5 121℃，20min 高压灭菌

  11. 2.溶液 溶液Ⅰ 200ml 50mmol/L 葡萄糖 1.98g 25mmol/L Tris-Cl(pH 8.0) 5ml 1M 10mmol/L EDTA(pH 8.0) 5ml 0.4M 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 溶液Ⅲ 5mol/L 醋酸钾 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml (最终pH4.8)

  12. 3.分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 4.无水乙醇 5.70%乙醇 6.TE缓冲液 (pH8.0) Tris-HCl 10mmol/L EDTA-Na2 5mmol/L

  13. 四、实验步骤 接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素的LB 液体培养基 37℃摇培过夜（10~12h） 12000rpm, 3min 弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。 加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀 配制适量的Ⅱ液 加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜）， 冰浴，5-10min，此时应有丝状物出现。

  14. 加150μl Ⅲ液，轻轻混匀， 冰浴，5min以上 此时应有絮状物出现。 ↓12000rpm, 5min 取上清液，加等体积的酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色，5min ↓12000rpm, 10min 取上清液，加2倍体积的冷乙醇，混匀，-20℃，30min ↓12000rpm, 10min 弃去上清液，用70%乙醇清洗沉淀 ↓干燥 加20μl TE溶解，4℃保存

  15. β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 诱导剂IPTG lacZ- β-半乳糖苷酶- α-肽段 分解X-gal 产物呈现蓝色 返回

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