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人禽流感的实验室检测

人禽流感的实验室检测. 广州市第八人民医院检验科 卢业成 副主任技师. 图一 禽流感病毒图解. 禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。 目前为止，已证实能感染人的禽流感病毒亚型有 H5N1 、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3 等。 对有机溶剂敏感；常用消毒剂易将其灭活。对热敏感，对低温抵抗力强。紫外线直接照射可迅速破坏其活性。. 禽流感病毒对禽致病性强弱划分的依据. 禽流感病毒根据对禽致病性不同，可分为高、中、低三种，其划分依据： 在无类胰蛋白酶条件下，形成融斑的能力； 病毒颗粒 HA 蛋白分子上连接肽碱性氨基酸的多寡； 静脉致病指数：

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人禽流感的实验室检测

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  1. 人禽流感的实验室检测 广州市第八人民医院检验科 卢业成 副主任技师

  2. 图一 禽流感病毒图解 • 禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。 • 目前为止，已证实能感染人的禽流感病毒亚型有H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3等。 • 对有机溶剂敏感；常用消毒剂易将其灭活。对热敏感，对低温抵抗力强。紫外线直接照射可迅速破坏其活性。

  3. 禽流感病毒对禽致病性强弱划分的依据 禽流感病毒根据对禽致病性不同，可分为高、中、低三种，其划分依据： • 在无类胰蛋白酶条件下，形成融斑的能力； • 病毒颗粒HA蛋白分子上连接肽碱性氨基酸的多寡； • 静脉致病指数： 2.0～3.0（波动1.74～3.0） 为高致病性 1.2～1.4 为中致病性 0（波动0～1.0） 为低/非致病性

  4. 为何高致病性H5N1亚型禽流感病毒至今仍不具有人传人能力？为何高致病性H5N1亚型禽流感病毒至今仍不具有人传人能力？ 一般认为高致病性H5N1亚型禽流感病毒至今仍不具有人传人能力的原因为： • 它们的基因组中不含有人流感病毒基因节段； • 它们的受体特异性，不同于人流感病毒； • 它们的HA蛋白分子上连接肽含多个碱性氨基酸。

  5. 一、实验室检测目的 1、提供确诊病例的实验依据（病原学/血清学）。 2、及时分离出人禽流感病毒并了解其亚型。 3、及时了解病毒株基因组及抗原特性，为疫情预测和 预防提供科学依据，建立我国人禽流感病毒基因库。 A、是否含有人流感病毒基因节段。 B、受体特异性。 C、HA蛋白分子上连接肽碱性氨基酸的多寡。 4、了解所分离毒株的来源。 5、为诊断试剂制备和疫苗生产提供毒株，同时也为抗 体测定提供合适的抗原。 6、通过耐药试验，为治疗药物使用提供科学依据。

  6. 二、实验室生物安全 按照《禽流感实验室检测技术方案》及《传染性非典性肺炎实验室生物安全操作规范》的要求： • 凡操作活病毒的试验（如微量中和试验、特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒分离、尸检标本的检测）必须在生物安全III级（BSL-3）的条件下进行。 • 其余的试验（如特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测）可在生物安全II级+（BSL-2+）的条件下进行。 按照《禽流感职业暴露人员防护指导原则》的要求： • 实验室工作人员应采取相应的生物安全防护，并经过相应的专业技术培训。

  7. 三、标本的采集、包装、运送及保存 1、采集对象 • 人禽流感疑似病例，临床诊断，确诊病例。 • 人禽流感疑似病例，临床诊断，确诊病例的密切接触者，一周内出现流感样症状者。 • 与患禽流感的病、死禽密切接触者，一周内出现流感样症状者。 • 不明原因肺炎住院患者。 • 其他根据需要采集的对象。 2、采集人员 经过技术培训的医生、护士、CDC工作人员。

  8. 三、标本的采集、包装、运送及保存 3、标本种类及采集时机 • 上呼吸道标本：包括鼻拭子，鼻咽拭子、鼻咽抽提物、鼻洗液、咽漱液。最佳采集时间为发病后3天内，一般不超过7天。 • 下呼吸道标本：只采集重症患者，无时间限制。包括气管吸取物、支气管洗液、肺组织活检标本。 • 尸检标本：病人死亡后应尽早进行解剖。无菌条件下主要采集肺和气管，条件允许下，也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等。每种组织应多部位取材，每部位应取20～50g，淋巴结取2个。 • 血清标本：要空腹采集，采集量为3～5ml。急性期血样应尽早采集，不晚于发病后7天；恢复期血样在发病后2～4周采集（要注意病人是否真正康复和停药）。

  9. 三、标本的采集、包装、运送及保存 4、采集方法 各种标本的采集方法参见《人禽流感样品采集、运输和检测技术规范（试行）》。 5、标本包装 • 标本必须保存于大小合适、带垫的外螺旋盖的塑料管中，管外写明标本编号、病人姓名及采样日期。 • 将保存标本的塑料管放入大小适合的塑料袋内密封，每袋只装一个标本。 • 标本相关的详细信息填写“广东省禽流感疑似病例样本送检登记表”，用塑料袋密封。

  10. 三、标本的采集、包装、运送及保存 6、标本保存 • 用于病毒分离的标本应尽快进行接种，能在24小时内接种的标本可置于 4℃冰箱暂时保存，不能在24小时内接种的标本应置于 -70 ℃或以下保存。如无 -70 ℃保存条件，则于 -20 ℃冰箱暂存。 • 血清标本可在 4 ℃冰箱保存 1～3天，-20 ℃或以下可长期保存。标本运送期间应避免反复冻融。 • 所有标本一式两份，其中一份单独保存，以备复核。

  11. 三、标本的采集、包装、运送及保存 7、标本运输 标本放入专用运输箱内，四周放置冰袋，空隙部分用具有吸水和缓冲性能的材料充填。病毒分离用标本可置液氮运输罐内用于长距离运送，所有运送容器外必须具有生物危险标记。

  12. 四、人禽流感的实验室检测 1、经典检测方法 • 病毒分离与鉴定：用SPF鸡胚单腔法和MDCK组织细胞分离培养，培养物用HI和NI法进行鉴定。 • 微量血清中和实验 （参见《广东省流感监测工作规范》） 2、快速检测方法 • 核酸检测：RT-PCR或Real Time PCR，建议使用中国流感中心或WHO权威部门推荐的引物和探针。 • 检测抗原的快速诊断试剂盒：敏感性较低，只能测型特异。 • 免疫荧光测定：用亚型特异的单抗标记。

  13. 四、人禽流感的实验室检测 3、血清学试验 • 主要是测定患者血中的禽流感病毒抗体。 • 采急性期和发病后2～4周恢复期的双份血清同步检测。恢复期血清抗体滴度增高4倍或4倍以上判断为阳性。 • 常用ELISA、免疫荧光等方法，有专用商品试剂盒供应。 4、常规检验项目 • 血常规： • 肝肾功能： • 心肌酶： • 血气分析：

  14. 四、人禽流感的实验室检测 5、检测结果的判断 阳性结果 • H5、H7、H9基因核酸检测，具备以下任何一条： 1)两对亚型特异性引物都能扩增出预期大小的产物 2)一对亚型特异性引物的扩增产物其序列经比对证实 • 用亚型特异的单抗，免疫荧光测定阳性 • 病毒分离及鉴定 • 血清学实验：抗体滴度有4倍或以上升高

  15. 五、人禽流感实验室检测应注意的问题 • 把握好临床标本的采集时机。 • 严格按照有关规定开展检测工作，切实做好标本的上送及转运工作。 • 严格按照有关规定做好实验室生物安全防护，妥善处理废弃标本和实验室产生的医疗垃圾。 • 严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。 • 禽流感病毒在 -20℃～-40℃时不稳定，长期保存应在 -70℃以下。

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