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第十三章 DNA 的生物合成

第十三章 DNA 的生物合成. DNA 是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。 生物体的遗传信息就贮存在 DNA 的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。. DNA 通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。 DNA 的复制、转录和翻译过程就构成了 遗传学的中心法则 。

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第十三章 DNA 的生物合成

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  1. 第十三章 DNA的生物合成 • DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。 • 生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。

  2. DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。 • 在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。

  3. DNA dependent DNA polymerase——DDDP DNA dependent RNA polymerase——DDRP RNA dependent RNA polymerase——RDRP RNA dependent DNA polymerase——RDDP

  4. DNA生物合成有两种方式：DNA复制和反转录 DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状） DNA的体外复制：分子克隆。

  5. 第一节 DNA的复制 一、 DNA的复制特点 （一）、半保留复制 • DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。

  6. 1、DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：

  7. 2、、复制起始点 • DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。

  8. DNA复制的调控是在起始阶段进行的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。DNA复制的调控是在起始阶段进行的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。 复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不在同一点上（不对称复制，如D环复制）。 在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。 多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含A.T。

  9. 3、、需要引物 • 参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。 • RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。

  10. 3、、双向复制 DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

  11. （二）、半不连续复制 • 由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3'→5'。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。

  12. 以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leading strand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(lagging strand)。

  13. 由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。 • 冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

  14. 二、 DNA复制的条件 （一）、底物 • 以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。 (dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi

  15. （二）、模板(template) • DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

  16. （三）、引发体和RNA引物 • 引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。 • 引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。蛋白i、蛋白n、蛋白n”、蛋白dnaC与引物预合成有关，蛋白n’与蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。 • 引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

  17. （四）、DNA聚合酶(DDDP) 1、种类和生理功能： • 在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶Ⅰ（pol Ⅰ），DNA聚合酶Ⅱ（pol Ⅱ），DNA聚合酶Ⅲ（pol Ⅲ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol Ⅲ和pol Ⅰ。

  18. pol Ⅰ为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenow fragment，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性。

  19. pol Ⅲ由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3'→5'外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。

  20. 原核生物中的三种DNA聚合酶

  21. 在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α（pol α），DNA聚合酶β（pol β），DNA聚合酶γ（pol γ），DNA聚合酶δ（pol δ），DNA聚合酶ε（pol ε）。 • 其中，参与染色体DNA复制的是pol α（延长随从链）和pol δ（延长领头链），参与线粒体DNA复制的是pol γ，polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，pol β只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

  22. 2、DNA复制的保真性： 为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关： • 遵守严格的碱基配对规律； • DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择； • 对复制过程中出现的错误及时进行校正。

  23. （五）、DNA连接酶 • DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。

  24. DNA连接酶催化的条件是：① 需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；② 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③ 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。

  25. （六）、单链DNA结合蛋白 • 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：① 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；② 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

  26. （七）、解螺旋酶 • 解螺旋酶（unwinding enzyme） ，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。

  27. （八）、拓扑异构酶(topoisomerase) • 拓扑异构酶Ⅰ可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。 大肠杆菌拓朴异构酶Ⅰ的结构

  28. 三、 DNA生物合成过程 ＃复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。 （一）预引发： 1．解旋解链，形成复制叉： • 由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。 • DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。

  29. 2．引发体组装： • 由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。

  30. （二）引发： • 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

  31. ＃复制的延长 （一）聚合子代DNA： • 由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的亲代DNA链为模板，从5'→3'方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长随从链)和δ（延长领头链）。

  32. （二）引发体移动： • 引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

  33. ＃复制的终止 （一）去除引物，填补缺口： • 在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。

  34. （二）连接冈崎片段： • 在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

  35. （三）真核生物端粒的形成： • 端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。 • 一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的结构。 • 功能： ⑴保证线性DNA的完整复制 ⑵保护染色体末端 ⑶决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。

  36. 线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。 • 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

  37. 端粒酶(telomerase)的作用机制

  38. 人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。

  39. # DNA复制的真实性 生物体DNA复制具有高度真实性，复制107-1011碱基对,只有一个错误碱基。 碱基对的自由能通常在4-13KJ/mol，这样的自由能相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10-2。

  40. 1、   DNA聚合酶对碱基的选择作用 酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的dNTP能长时间停留，而参与聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端。 酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。 动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP结合在酶与模板—引物复合物的聚合位点上，DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。 DNA聚合酶对底物的识别作用，DNA聚合酶有两种底物，一种是DNA模板—引物，另一种是dNTP。 DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3，未端，再识别底物dNTP，是一种有序的识别过程。

  41. 2、   3，→5，外切活性的校正阅读 E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3，→5，外切活性，可删除错误插入的核苷酸。 缺失3， →5，外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化DNA合成时，出现错误的几率增高5-50倍。因此，3，→5，外切活性可以使DNA复制的真实性，提高1-2个数量级。

  42. 3、   影响DNA合成真实性的因素 ⑴高浓度NMP(如3，-AMP, 5，-GMP) NMP竞争酶的dNTP结合位点，抑制3，→5，外切活性。 ⑵某一种dNTP浓度银高,可使引物3，末端离开外切活性中心。 ⑶dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子（如Mn2+）代替Mg2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和3，→3，外切活性。

  43. 4、   为什么用RNA引物 ⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配 ⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。

  44. 第二节 逆转录 • 以RNA为模板，合成DNA，称为逆转录（reverse transcription）。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，又称为反转录。 • 致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。

  45. 所有已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶，因此被称为反转录病毒（retrovirus），反转录病毒的复制需要经过一个DNA中间体（前病毒）。所有已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶，因此被称为反转录病毒（retrovirus），反转录病毒的复制需要经过一个DNA中间体（前病毒）。 反转录病毒的基因组结构的特点： （1）反转录病毒基因组通常由两条相同的（+）RNA链组成。5’端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10Kb。 （2）每一条RNA链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。 （3）5’端有帽子结构，3’端有polyA，与真核mRNA相似。 （4）5’端带有1分子的宿主tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp，鼠类是tRNApro

  46. 1986年7月25日，世界卫生组织（WHO）发布公报，国际病毒分类委员会会议决定，将艾滋病病毒改称为人类免疫缺陷毒（Hmuan Immunodeficiency Virus）简称HIV。

  47. HIV呈袋状球形，直径约150毫微米，包膜由一薄层类脂质构成，具有抗原性。HIV呈袋状球形，直径约150毫微米，包膜由一薄层类脂质构成，具有抗原性。 • HIV有10%碱基序列不同。 • 是单链RNA病毒， • 外有核壳蛋白， • 还有一种特殊的 逆转录酶，以单链RNA 作为模块，转录为双链 DNA，该双链DNA可 与宿主细胞的DNA结合然后逆转录为病毒的单链DNA， • 因此感染艾滋病病毒后，病毒的核酸永远与宿主细胞结合在一起，使得感染不能消失，机体无法清除病毒。

  48. 一、逆转录的条件 1.逆转录酶 • RNA指导的DNA聚合酶活力；RNase H酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA；DNA指导的DNA聚合酶活力。 2.模板(RNA或DNA) • 以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。 3.引物(RNA或DNA) • 引物不少于四个核苷酸。 4.底物：dNTP 5.二价阳离子：Mg2+或Mn2+

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