Борисова П. Научны e руководители: Волкова П.А. Ильинский В.В.

1. Поиск диагностических морфологических признаков и генетических маркеров уели европейской (Picea abies) иели сибирской (P. obovata)и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии Борисова П. Научныe руководители: Волкова П.А. Ильинский В.В.

2. Введение P. obovata Зона гибридизации P. abies

3. P. abies P. obovata Зона гибридизации ледник

4. Цель поиск видоспецифичных морфологических диагностических признаков и генетических маркеров у P. abies иP. obovata и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии.

5. Материалы и методы 141 дерево (149 шишек), 10 популяций Северная Карелия (4) Ненецкий АО (1) Красноярский край (2) Германия (3)

6. Наша работа

7. Морфология P. obovata P. abies Длина шишек: 4-6 (8) см 10-16 см

8. коэффициент сужения: DSL/HS*100 коэффициент вытянутости: (LS-DS)/HS*100 значение разности коэффициентов сужения и вытянутости: P. abies P. obovata – 5 5

9. Геометрическая морфометрия – описание формы без размеров объекта

10. Классическая морфометрия • Длина шишки, наибольшая ее ширина и расстояние до нее от основания шишки; для чешуи – аналогично • Вторичные показатели: отношение длины к ширине и отношение положения наибольшей ширины к длине для чешуи и шишки • коэффициенты сужения и вытянутости и их разность

11. Геометрическая морфометрия

12. ь Распределение исследованных образцов в пространстве двух первых главных компонент (классификация по совокупности морфологических промеров)

13. Длина шишек для популяций С. Карелия P. obovata P. abies

14. Отношение длины шишки к ее ширине С. Карелия P. obovata P. abies

15. Разность коэффициентов сужения и вытянутости С. Карелия P. obovata P. abies

16. Распределение исследованных растений в пространстве двух первых главных компонент для результатов геометрической морфометрии

17. Усредненные контуры чешуй

18. Молекулярно-генетическая часть Постепенный переход P. abies P. obovata изменение частот аллелей некоторых генов с запада на восток Маркеры в хлоропластной и митохондриальной ДНК Разграничивают виды, но важны частоты маркеров в популяции => нужны большие выборки полиморфизм одиночных нуклеотидных замен (Single nucleotide polymorphism, SNP) Возможно использовать для различения видов

19. Материалы и методы Поиск нужных участков ДНК (по базе данных) Подбор праймеров Выделение ДНК Получение копий этих участков (ПЦР) Электрофорез определение последовательности нуклеотидов

20. Результаты и обсуждение Выбранные последовательности ДНК(в скобках – условные названия) 4 участка ДНК – • два ядерных (220и 467), • один митохондриальный (МТ) • один хлоропластный (TRN)

21. Подбор параметров ПЦР 58°, 10 сек 60°, 10 сек 62°,10 сек 61°, 10 сек 64°, 5 сек 60°, 5 сек 65°, 5 сек 67°, 5 сек

22. SNP в 427 позиции для участка для хлоропластного участка. GB – последовательности GenBank Полученные последовательности

23. SNP для ядерного участка (220)GB – последовательности GenBank

24. Выводы • Найден участок хлоропластной ДНК, который можно рекомендовать для дальнейшей разработки маркера для разграничения P. abies и P. obovata. Разработаны праймеры и подобраны оптимальные параметры ПЦР для анализа SNP на этом участке. • P. abies, P. obovata различаются длинной шишек и формой чешуи, описанной как классической, так и геометрической морфометрией. • Карельские ели, согласно данным геометрической морфометрии, относятся к P. × fennica, согласно классической морфометрии – к P. obovata .

25. Благодарности Часть материала для настоящей работы собрана в ходе Беломорской экспедиции Московской гимназии на Юго-Западе (№1543). Автор благодарит научных руководителей Волкову Полину Андреевну и Ильинского Валерия Владимировича; Л. Абрамову, П. Волкову, П. Петрова, А. Еськову, Е.Трушину, К. Трушина за помощь в сборе материала. Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в написании работы, а так же коллектив ЦКП «Генный полиморфизм» за предоставленную возможность проведения работы. Также автор признателен рецензенту Д. Кнорре за ценные замечания о данной работе и С. М. Глаголеву за организацию практики.

26. Спасибо за внимание

27. Геометрическая морфометрия • Метод тонких пластин • 20 равноудаленных точек по всему контуру • Координаты меток – экранный дигитайзера tpsDig • Координаты эталонной конфигурации, значения главных, относительных и частных трансформаций – программа tpsRelw • Усредненные контуры чешуй – программа tpsSuper • Редактирование и конвертирование файлов данных – вспомогательная программа tpsUtil

28. Расположение карельских популяций Чупа биостанция губа Чупа Кандалакшского залива Белого моря

29. Анализ главных компонент • Однофакторный дисперсионный анализ с последущим попарным сравнением выборок тестом Вилкоксона с поправкой Бонферрони. • Использовали статистическую среду R

31. значения коэффициента вытянутости (CP)

32. коэффициент сужения (CN)

33. Отношение положения наибольшей ширины чешуи к ее длине (DC/LC)

34. Геометрическая морфометрия

36. Выделение ДНК • ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К 10-20 хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl pH 8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец вместе с буфером гомогенизировали в фарфоровой ступке. После проводили очистку ДНК с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski, Sacchi, 1987): • Добавляли 400 мкл фенола pH=7,2, хорошо перемешивали. • Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), хорошо перемешивали. • Центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин (16000 g). • Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли в нее 800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали. • Центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин. • Полностью удаляли надосадочную жидкость. • Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали. • Центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин • Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали осадок при комнатной температуре (не более 10 мин). • Растворяли осадок в 50 мкл TE (Tris EDTA) буфера путем инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием. • В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С.

37. Общий объем смеси для ПЦР на одну пробирку составлял 25 мкл • 17,5 мкл воды • 2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера • 0,5 мкл раствора dNTP's (25мМ каждого) – дезоксинуклеотидтрифосфатов • 0,15 мкл каждого праймера • 1 мкл ДНК • 0,5 мкл HS Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген»)

38. Результаты и обсуждения Выбранные видоспецефичные последовательности ДНК