Download
1 / 55
550 likes | 690 Views
原核生物的基因转录. PPT 制作 03 级生物技术 黄婉珺 叶晓婷 周铁标 林敏杰. 目 录. 引言 RNA 聚合酶 启动子 转录过程. 一、引 言. 转录（ Transcription ）是指合成一条 RNA 链的过程，用该 RNA 链 “ 代表 ” DNA 双链中的一条链。 “ 代表 ” 的意思是指此 RNA 与 DNA 双链中的一条链具有完全相同的序列，这条 DNA 链称为编码链（ Coding strand ）。这样， RNA 的序列就与另一条作为合成模板（ Template ）的 DNA 链互补。.
E N D
原核生物的基因转录 PPT制作 03级生物技术 黄婉珺 叶晓婷 周铁标 林敏杰
目 录 • 引言 • RNA聚合酶 • 启动子 • 转录过程
一、引 言 • 转录（Transcription）是指合成一条RNA链的过程，用该RNA链“代表”DNA双链中的一条链。“代表”的意思是指此RNA与DNA双链中的一条链具有完全相同的序列，这条DNA链称为编码链（Coding strand）。这样，RNA的序列就与另一条作为合成模板（Template）的DNA链互补。
RNA 合成由 RNA 聚合酶（RNA polymerase）催化。当 RNA 聚合酶结合到一个称为启动子（Promoter）的特殊区域时，转录就开始了。启动子位于RNA转录产生的第一个碱基对附近。RNA聚合酶从转录起始位点（Start point）开始沿模板边移动边合成RNA，直至终止序列。从启动子延伸到终止子（Terminator）所跨越的部分称为一个转录单位（Transcription unit），它代表的 DNA 被转录成为一个单链 RNA 分子，在此过程中自身得到表达。一个转录单位可以包含一个以上的基因。
转录是基因表达的第一个阶段，也是被调控的重要步骤。转录调控蛋白（Regulatory Protein）决定了一个基因能否被 RNA 聚合酶转录。对转录的起始步骤（有时甚至是唯一步骤）进行调控决定了一个基因转录与否。另外，因为转录是分不同阶段进行的，这些阶段为基因活性的调控提供了其它机会。
以下是关于基因表达的两个基本问题： • RNA 聚合酶如何找到 DNA 上的一个特异性启动子？这表面上看起来特殊的例子却代表了一个非常普遍的问题：蛋白质如何将它们的特异DNA结合位点与其它序列区分开？ • 调控蛋白是如何与 RNA 聚合酶相互作用来激活或阻遏转录的起始、延伸，或终止的？
在本章里，我们将分析细菌RNA聚合酶与DNA的相互作用：从它与基因开始接触到转录过程的进行，以及转录完成后聚合酶的释放。在本章里，我们将分析细菌RNA聚合酶与DNA的相互作用：从它与基因开始接触到转录过程的进行，以及转录完成后聚合酶的释放。
二、RNA聚合酶 • 细菌的RNA聚合酶，其活性形式(全酶)为15S，由5种不同的多肽链构成，按分子量大小排列分别为β(155000)β(151000)，σ(7000)，α(36500)和ω(11000)。每分子RNA聚合酶除有两个α亚基外，其余亚基均只有一个，故全酶为β'βα2σω(450000)。
如果全酶为球状，则可计算其直径约为100A，即约为双链DNA的30bp节段的长度。然而全酶可结合约60个核苷酸，提示其形状应为椭圆球形。如果全酶为球状，则可计算其直径约为100A，即约为双链DNA的30bp节段的长度。然而全酶可结合约60个核苷酸，提示其形状应为椭圆球形。
核心酶 ：当σ亚基脱离全酶后，剩下的β‘βα2ω ，它本身就能催化核苷酸间磷酸二酯键的形成，不论有无σ存在的利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)能结合在β亚基上而对此酶发生强烈的抑制作用。
β亚基是酶和核苷酸底物结合的部位； • α亚基的功能可能是识别其相应的启动子 。
E．coli的RNA聚合酶各亚基的基因 • 存在部位：三个操纵子 （1）P71主要启动子(P)均在操纵子的左侧，RNA则向右方合成。 （2）σ操纵子中的一个启动子(PHS，是在热休克条件下才有活性的启动子)，均位于操纵子之内。 （3）β操纵子的前面两个基因L11和L1，这些基因编码50个左右核糖体蛋白质中的某些蛋白质 。
这些操纵子中的基因并不是相等地被转录的：在σ和β操纵子开始中的核糖体蛋白质基因的后面有衰减子(attenuators)，可使其后的RNA聚合酶基因的转录大为降低。这些操纵子中的基因并不是相等地被转录的：在σ和β操纵子开始中的核糖体蛋白质基因的后面有衰减子(attenuators)，可使其后的RNA聚合酶基因的转录大为降低。 • 在每个细胞中RNA聚合酶亚基的数目(约3000个)要大大少于核糖体蛋白质的分子数(约20000个)，这是符合细菌的需要的。
三、启动子 • 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。 • 启动子一般可分为两类: • （1）一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子。 • （2）另一类启动子在和聚合酶结和时需要有蛋白质辅助因子的存在。
启动子的共同顺序 • 将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下,-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序(consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。
-10和-35这两个部位都很重要： （1）RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主链中的磷酸基相接触 （2）离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱 （3）破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基，其余25%亦为离共同顺序较近的
RNA聚合酶与启动子的结合 大肠杆菌的RNA聚合酶与启动子结合的过程可分为两步 ： • （1）酶找到启动子顺序并与其以“关闭”复合体形式(即双螺旋形式)相结合。这一步所识别的是-35序列，因为-35序列的突变损害启动子的结合。 • （2）“关闭”复合体转变为“开放”复合体(即双螺旋被解旋，两条链分开)。
不同启动子需要不同σ因子 E．coli细胞中主要的σ因子可与核心酶一同被纯化，称为σ70，但菌细胞中另外有一些σ因子能够识别其顺序与E.coli的主要启动子不同的另一些启动子，并促使核心酶起始转录。这些变异的σ因子在细胞中有特别功能，通常能剧烈改变细胞RNA的合成方式，以便在需要时使一组全新的基因得以表达。这是在枯草杆菌(Bacillus subtilis)中首次发现的，它们的作用是开启在芽胞形成(sporulation)过程中需要的一整套新的蛋白质的表达。噬菌体往往有其自己的σ因子，借以在噬菌体发育的某一特殊阶段开动其所需要的某些噬菌体基因的转录。
调节蛋白与启动子的结合 • 阻遏蛋白(repressor)：有的能阻断RNA聚合酶的结合，从而抵制转录的蛋白。 • 激活蛋白(activator)：能与RNA聚合酶结合并提高其活性的蛋白。
模板的超螺旋张力 • 与DNA模板的超螺旋张力有关的酶： • （1）旋转酶：旋转酶(gyrase)能使细菌的DNA保持超螺旋状态，故有利于解旋 。它能抑制剂萘啶酮酸可以抑制许多基因的表达。 • （2）拓扑异构酶Ⅰ ：能阻止负超螺旋，此酶可使过度的负超螺旋松弛。 它有增强某些基因的表达的作用。
此外，某些启动子对超螺旋张力很敏感，而另一些则不很敏感。可能性之一是每个启动子对超螺旋的依赖程度不同，这取决于其不同的顺序。 • 启动子处于染色体的什么区域就是一种重要因素。
RNA合成的起始 • 在E.coli中，RNA链的起始通常是在RNA聚合酶所结合的DNA区域的一端，在解开的双链部分，离-10开始处大约12或13个碱基处。第一个核苷酸通常是pppA或pppG,较少为pppC，但偶而亦可为pppU。有时转录可在好几个相邻核苷酸处起始，也就是说RNA聚合酶似乎是可屈伸的，它能覆盖和巡游解链区的一部分，设法找出一个嘌呤作为起始，而嘧啶是它的第二选择。
然而从细胞内分离出的RNA分子的5'端的核苷酸却不一定是起始转录的核苷酸。因为在合成后许多RNA链还要经过内切核酸酶加工，切成较小片段，而这些片段完全可以由嘧啶起始。例如，虽然某些tRNA链的起始是U，但它们从不含有末端三磷酸基团。它们是在体内由长链RNA切割而成的。实际上所有细胞均含有许多种核酸酶，实验室中在体外合成的RNA则往往不受核酸酶的作用。然而从细胞内分离出的RNA分子的5'端的核苷酸却不一定是起始转录的核苷酸。因为在合成后许多RNA链还要经过内切核酸酶加工，切成较小片段，而这些片段完全可以由嘧啶起始。例如，虽然某些tRNA链的起始是U，但它们从不含有末端三磷酸基团。它们是在体内由长链RNA切割而成的。实际上所有细胞均含有许多种核酸酶，实验室中在体外合成的RNA则往往不受核酸酶的作用。
σ因子的解离 • RNA链的延伸阶段开始后，σ因子即从核心酶-DNA-新生RNA复合体上解离下来，并可再用于和新的核心酶结合，一般认为，σ因子之所以被释放出是因为此时它已不起作用了，但也可能是因为σ因子如仍然存在将会造成RNA聚合酶与启动子序列结合过紧，以致不能再沿着模板移动。所以当新生链-酶复合体与DNA模板的结合很弱，并且酶亦不再要求与特异序列的DNA结合时，链的延伸才能达到最佳状态。
DNA的解链和重复螺旋化 • RNA聚合酶在延伸新生RNA链时继续使DNA螺旋解链，以便暴露出模板链，RNA链的生长点是大约12bp长的RNA-DNA杂交区。在RNA链离开模板时，此杂交区即复原，同时两条DNA链即又重复螺旋化。而被延伸的酶所解开的DNA链的长度约为17bp，略长于RNA-DNA杂交链，而与在启动子形成的"开放"复合体的解链区的长度相等。
测定被RNA聚合酶解链的DNA的长度的方法是,在正在转录的共价闭环DNA上用拓扑异构酶使之松弛，然后加入去垢剂以除去RNA聚合酶和RNA，最后测定DNA分子的超螺旋数，在拓扑异构酶作用下每解链10.4bpDNA即可使DNA生成一圈新的负超螺旋，所以如已知有活性的酶分子的数目，即可算出每分子RNA聚合酶所解链的bp数目。测定被RNA聚合酶解链的DNA的长度的方法是,在正在转录的共价闭环DNA上用拓扑异构酶使之松弛，然后加入去垢剂以除去RNA聚合酶和RNA，最后测定DNA分子的超螺旋数，在拓扑异构酶作用下每解链10.4bpDNA即可使DNA生成一圈新的负超螺旋，所以如已知有活性的酶分子的数目，即可算出每分子RNA聚合酶所解链的bp数目。
转录因子NusA • NusA蛋白质多年来被忽视。这是因为RNA聚合酶的基本活性并不需要NusA，同时NusA也不和RNA聚合酶一起被纯化。λ噬菌体的N基因编码的蛋白是一种调节因子，它的功能是在λ噬菌体生长时防止转录的终止(抗终止作用)。而NusA蛋白能和N基因编码的蛋白紧密结合，这表示NusA在RNA合成中有重要作用。NusA与RNA聚合酶核心酶相结合。这类似σ因子，但不太紧密，故在纯化时往往σ因子取代了NusA。
在细胞内则当σ因子从RNA聚合酶内释出时，NusA才能与核心酶结合。然而在RNA链延伸时，NusA亦不固定地和一个RNA分子相结合，因为已发现在转录时一个NusA分子可与好几个RNA聚合酶分子相作用。所以即使活细胞内NusA分子不多(估计每个细胞只有数百个)，仍然是够用的。很可能当RNA聚合酶从DNA上释出后，σ因子又马上取代了NusA蛋白。在细胞内则当σ因子从RNA聚合酶内释出时，NusA才能与核心酶结合。然而在RNA链延伸时，NusA亦不固定地和一个RNA分子相结合，因为已发现在转录时一个NusA分子可与好几个RNA聚合酶分子相作用。所以即使活细胞内NusA分子不多(估计每个细胞只有数百个)，仍然是够用的。很可能当RNA聚合酶从DNA上释出后，σ因子又马上取代了NusA蛋白。
转录终止信号 • 细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子(terminator)终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。在终止子处，RNA聚合酶停止其聚合作用，将新生RNA链释出，并离开模板DNA。在某些位点处，终止需要一种辅助蛋白质，即ρ因子，但在其他位点处，核心酶本身即可终止转录。
对细菌和噬菌体中的终止子，特别是不需要ρ因子的，做了许多顺序分析。不依赖ρ因子的终止子有两个特征:对细菌和噬菌体中的终止子，特别是不需要ρ因子的，做了许多顺序分析。不依赖ρ因子的终止子有两个特征: • [1]DNA顺序有双重对称(dyad)，位于RNA3'端之前15-20核苷酸处，和[2]DNA模板链中有一串约6个A，转录为RNA3'端的U(图3-11)。双重对称的意义在于其转录本能形成发夹结构。体外实验显示，如果掺入其他碱基以阻止发夹形成时，终止即不发生。
通常只要有一个核苷酸的改变破坏了规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。对终止子突变的分析亦显示DNA模板上多聚dA顺序的重要性。如将此序列中的一个碱基换掉，或除去部分序列(缺失)都可使终止子失活。
