探索土壤细菌群落作为生物资源的潜能

1. 探索土壤细菌群落作为生物资源的潜能 程强强

2. 综述背景介绍 1：土壤作为微生物存储仓库，常用来筛选应用于工业，农业和环境方面有用的细菌。 2：我们只依靠传统的富集和培养技术来研究土壤细菌群落中那一小部分可培养细菌。只占0.1%-10%。大约有5000种 3：传统方法限制了对微生物群的检测 4：富集培养是选择快速增长的细菌具有高增长的产量和那些适合生长在培养基中培养的。因此，也不能保证这些培养出来的细菌在它们的环境中扮演着重要的作用。事实上，已经观察到有很多环境样本中的细菌扮演着很重要的角色，但很难在培养基中富集得到。

3. 5：分子微生物生态学，这门科学是利用分子生物学方法研究微生物种群系统发生和微生物生态的一种途径。他的基础是直接从环境样品中提取DNA分子。他开辟了研究探索土壤微生物多样性的新领域，也为探索农业，工业，环境和健康问题的研究向前推进了一步，这个简短的综述的焦点在于用稳定的分子生物学工具和技术了解土壤微生物种群多样性在土壤中的结构和功能，这是生物资源技术研究了特定微生物潜能的序幕。5：分子微生物生态学，这门科学是利用分子生物学方法研究微生物种群系统发生和微生物生态的一种途径。他的基础是直接从环境样品中提取DNA分子。他开辟了研究探索土壤微生物多样性的新领域，也为探索农业，工业，环境和健康问题的研究向前推进了一步，这个简短的综述的焦点在于用稳定的分子生物学工具和技术了解土壤微生物种群多样性在土壤中的结构和功能，这是生物资源技术研究了特定微生物潜能的序幕。

4. 分子技术 1：从土壤中提取DNA 从样品中提取和扩增DNA是检测土壤微生物多样性分子操作的第一步，总DNA能被用来显示细菌群落中占主导地位的特异基因和研究物理和化学因素对土壤细菌分布的影响。因此，假如能够从土壤中直接提取DNA，就可能有土壤微生物种群的信息。 2：PCR技术 土壤细菌群落分析的下一步是从主体核酸中分离rRNA编码基因 ，设计你想得到细菌的rDNA特异性引物扩增DNA。 可利用的方法有real time-PCR, RT-PCR, Touchdown-PCR, Nested-PCR 和Minimum Cycles for Detectable roducts (MCDP)-PCR基因盒PCR技术

5. real time-PCR:是一种新技术依据PCR循环中的扩增动力学，可以量化土壤细菌丰度。 RT-PCR:是从RNA逆转录获得双链DNA，双链DNA模板经过特异引物扩增获得大量DNA拷贝 Touchdown PCR:是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环 巢式PCR:两对pcr引物被用来进行单位点扩增,他针对的是特异的高度的简并序列期望评估几个品种相对丰度。 基因盒PCR：设计目标重组位点，侧翼基因盒结合整合子已经被利用来从环境DNA中发现大数量新基因 尽管PCR技术史一种非常快捷的检测土壤细菌多样性的方法，但它本身所固有的局限性也要求我们仔细考虑的。特别是，各种DNA模板的扩增差异，模板浓度的敏感性，扩增DNA的浓度和嵌合序列信息都有可能影响到利用PCR技术评价细菌生物多样性的结果。

6. 3：基于PCR的DNA指纹技术 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP), 扩增rDNA限制性分析(ARDRA)，随机扩增多态性(RAPD)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)，温度梯度凝胶电泳(TGGE)，单链构象多态性(SSCP)，和核糖体间隔空间分析(RISA/IGS) 这些指纹技术提供了很好的理解复杂群落结构亲缘关系方法 末端限制性片段长度多态性：从群落中提取细菌DNA作为模板，用恰到的引物扩增，（16SrDNA经常被用来作为探针），扩增产物用限制酶来消化，最后从每一种物种中扩增来的片段酶解后的片段用来评价土壤细菌群落结构而不需要知道最后片断的序列。DNA片断的大小和丰度被用来评价细菌群落的遗传多样性。 ARDRA：用特异引物扩增rDNA，随后限制性分析扩增产物，这是一种灵敏的技术，具有高分辨率，提供土壤细菌群落水平可依赖的基因型特征。

7. 核糖体间隔序列分析（RISA）：是用来分析土壤体系中的物种成分，这个技术涉及到分析长间隔空间16SrRNA-23SrRNA的多态性，物种不同这个空间在50bp-1.5kb之间。随后的测序也能够用来分类鉴定一个群落中的特定种群。核糖体间隔序列分析（RISA）：是用来分析土壤体系中的物种成分，这个技术涉及到分析长间隔空间16SrRNA-23SrRNA的多态性，物种不同这个空间在50bp-1.5kb之间。随后的测序也能够用来分类鉴定一个群落中的特定种群。 RADP随机扩增多态性技术：是利用单个随机引物在底退火条件下扩增，这样引物并不特异性的互补于模板，几条分离的DNA条带被扩增出来。尽管RAPD分析快速和方便，但有不可重复性，即使是很小的变化，像不同批次的Taq酶，缓冲液都可以改变指纹。在自然中用RAPD技术直接扩增DNA的条件必须经过优化 DGGE：是利用 PCR扩增DNA片段的长度变化和他们在包含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中的移动。这已经被证明是一个有价值的方法获取16SrRNA基因概况识别时间和空间上的不同在水稻土壤中的细菌群落结构。当用rRNA基因 DGGE分析技术与测序或者进化探针杂交相结合时，可以用来评估群落中主要成员的系统发生关系 。

8. TGGE：是同一浓度的变性凝胶，而温度在整个电泳过程中均匀的升高。这种结果更容易重复比普通的DGGE 。 DGGE和TGGE比T-RFLP的优势在于能够被分离每一条带都代表了细菌群落的概况 SSCP：是一种区别同样大小但不同核酸序列的非变性凝胶电泳技术，SSCP是一个行之有效的方法分析利用在核糖体基因水平获得的一些同样大小而碱基序列不同的PCR产物，对土壤细菌群落的多样性进行研究。

9. DNA复性动力学和DNA：DNA杂交 使用DNA重组动力学技术大规模分析群落DNA，提供整个土壤微生物群落的总遗传多样性。这个方法基于这样的假设，高复杂性变性DNA复性速度要慢于底复杂性变性DNA，复性动力学正比于基因组复杂性。这种方法的优势在于它可能是唯一能够与日期为尺度的鉴定土壤样品细菌物种的总数 。 • 利用探针技术种群定位 探针技术有：荧光原位杂交技术，显微放射自显影术，稳定性同位素探测技术 这些方法能够详细的定量研究细菌群落结构和动态，为利用PCR为基础的方法为定量评估细菌相对丰度提供支持性证据。

10. FISH ：用荧光标记的寡核苷酸探针靶标选定的系统发育基因组的rRNA，已经可以用来区分靶标细菌的单个细胞。靶标rRNA保守位点，能够区分古细菌，细菌和真核生物，也能够鉴别大的系统发育组别的亚类 。 结合FISH和显微自显影技术能够直接分析在不同的自然条件下不同的微生物吸收底物。FISH识别特异的微生物，当显微放射自显影分析不同的居住条件下的吸收底物。 SIP：稳定同位素探针技术，能够分离正在活跃的进行微生物代谢过程的DNA 。 在含C13碳源上生长的有机体DNA被C13探针，与群落总的C12DNA通过密度梯度离心。DNA能够被分成几部分，利用基因探针进行功能分析，每一部分都能够进行更进一步的系统分类的分析。

11. 磷脂脂肪酸分析 PLAF 提取，鉴定和量化磷脂脂肪酸能够提供在土壤细菌群落中总的生物量信息。 常规分析微生物磷脂脂肪酸可结合选定细菌进行放射性同位素PLFAs分析土壤样品。这个技术提供了微生物的放射性磷脂脂肪酸指纹。这种方法用来研究微生物有机体在环境样品中自然和有毒性成分时代谢。 • DNA微阵列技术 为了评估微生物多样性与环境因子和生态复杂性的关系，有必要描述群落功能的多样性，和评价群落单个成员在不同环境条件下的活性。DNA微阵列技术有很大的潜能描述微生物群落和他们在环境中的功能。微阵列为基础的检测技术一方面对分析微生物群落结构，功能和动力学有巨大的潜能，另一方面优势是特异性，敏感性和定量和高通量检测工具，识别土壤环境中微生物特征

12. 结论 虽然目前这些技术的使用取得相当大的成功，但这些技术还有一些缺陷或限制，需要加以解决。这些技术为从非培养条件下找到有用的基因已经展现出了很大的希望，但表达这些基因仍需要在与原宿主菌环境接近的条件下。今后最大的挑战在于发展方法阐明非培养微生物和培养微生物的作用为开发细菌群落所有的生物能源的潜能。