High Performance Liquid Chromatography

1. High PerformanceLiquid Chromatography

2. Contents • Introduction. • Classification of Chromatography. • Theory • LC System • Troubleshooting.

3. Chromatography • 원리. - 시료가 칼럼을 지나는 동안, 각 성분의 이동도 차이를 이용해 혼합물의 각 성분을 분리하는 방법. - 분리과정은 각 성분의 이동상과 정지상 사이의 분배, 흡착, 이온교환, 시료 의 크기차이에 의존. • 역사. - 1903년 소련의 식물학자 Tsweltt가 최초로 유리관에 흡착된 흡착제(탄산 칼슘)를 충진 시키고 석유에테르를 사용하여 식물잎에 있는 엽록소 (클로로 필과 크산토필등)를 분리 하는 최초의 크로마토그래피 실험을 실시. - 주목할 만한 발전은 1941년 Martin과 Synge에 의해 발전된 하나의 흡착제 대신에 불용성 흡착제를 고정상에 결합시킨 고정액상을 사용한 액체-액체 크로마토그래피(LLC)이다. - 최근에는 High performance liquid chromatography(HPLC)가 널리 각광 받고 있는데 이는 비휘발성 용질이나 열에 약한 시료의 신속한 분리 기술.

4. Classification of Chromatography • 이동상의 종류에 따라 분류 할 수 있으면, 이동상이 gas인 경우에는 Gas chromatography(GC)이고, liquid인 경우에는 Liquid chromatography(LC)이고, gas와 liquid의 중간의 성질을 갖는 유체를 사용하는 Superitical fluid chromatography로 분류. • GC는 사용되는 고정상의 종류에 따라 고정상을 고체인 담체를 사용하여 기 체-기체 흡착평형이 분배과정을 통하여 이루는 GSC와 불활성인 고체 지지 체(Solid support)에 엷은 막으로 입혀진 액체를 고정상으로 사용하여 기체 와 액체 사이의 시료 성분들이 평형을 이루어 분리가 일어나는 GLC로 구분.

5. Figure 1. Classification of Chromatography. Chromatography Supercritical Fluid Chromatography Gas Chromatography Liquid Chromatography Gas-solid Gas-liquid Ion exchange Size exclusion Adsorption Partition Affinity Gel Filtration Gel permeation

6. Adsorption Chromatography • 원리. - 가장 오래된 chromatography 형태로, 이동상인 액체와 고정상인 고체 사이에서 시료가 고정상에 흡착되는 정도에 따라 분리. - 흡착제를 유리관 등의 관(column)에 충진시켜, 위쪽으로부터 시료용액을 흘려내려 보내면 시료가 흡착된다. 흡착제에 흡착된 시료는 용매를 관의 상부로부터 흘러내리게 함으로써 전개되어 관에 분리된 물질의 크로마토 그램를 형성. - GSC의 경우 이동상은 비활성 기체를 이용하므로 고정상에 대한 시료의 친화력 차이로 분리. • 흡착제(Adsorbent)의 종류. - 고정상으로 사용하는 물질은 실리카(SiO2), 알루미나(Al2O3), 마그네슘 옥사 이드 등이며, 그 중 실리카겔과 알루미나가 대표적.

7. Figure 2. Adsorption chromatography.

8. Partition chromatography • 원리. - 가장 많이 사용되는 크로마토그래피 방법이고, 고정상과 이동상인 사이에 시료가 분배되는 차이를 이용하여, 시료 성분은 끊임없이 고정상과 이동상 사이를 왕복하면서 컬럼내를 이동 하게 되고, 마침내 분리가 일어남. • 순상(Normal phase). - 고정상이 극성이고 이동상이 비극성이고, 비극성 화합물이 먼저 분리. - 고성상으로 사용되는 물질의 작용기는 Nitrile, Diol, Amino 등의 극성 작용 기로 이루어짐. • 역상(Reverse Phase). - 고정상이 비극성이고 이동상이 극성이고, 극성화합물이 먼저 분리. - 작용기는 탄소수가 8개 또는 18개인 비극성 체인으로 이루어짐. • 컬럼. - 고정상으로 사용되는 막이 쉽게 손상된다는 것이 단점이나 지지체와 화학 적으로 결합된 고정상을 사용하는 결합

9. Figure 3. Partition chromatography.

10. Ion-exchange chromatography • 원리. - 이온교환수지를 고정상으로 하고 산, 염기 또는 완충용액을 이동상으로 하 여 용질 이온상과 고정상 이온간의 이온교환에 의해 용질 이온을 분리. • 이온교환 과정. - 하전된 용질 이온 P-가 반대이온 X-와 대치되어 교환체 R+의 반대 전하 자 리에 부착. • - 용질 이온은 경쟁적으로 작용하는 염 이온 S-로 대치 되고, 칼럼으로 부터 용질을 분리하는 원리. • 이온 교환체. - 교차 결합된 polystyrene, polydextrans, cellulose, silica 등의 합성수지를 포함하는 다양한 물질들이 이온 교환체로 사용. R+X- + P- R+ P- + X- R+P- + S- R+ S- + P-

11. Figure 4. Ion-exchange chromatography chromatography. + + + + + + + + + + + + 정지상에 공유결합된 양이온 근처에 있는 이동성음이온 음이온교환수지

12. Size exclusion chromatography • 원리. - 다공성 비이온성 겔을 고정상으로 사용하며, 진동으로 분자를 크기에 따라 분리. - 큰 분자는 겔에 들어가지 않고 통과 하고 작은 분자가 겔 속에 들어 갈수 있어 컬럼을 빠져 나올 때 까지는 많은 양의 이동상이 필요 하다. • 분류.- Gel filtration chromatography(GFC) : 수용성 물질을 수성용매로 사용 하여 분리. - Gel permeation chromatography(GPC) : 비수용성 물질을 유기용매를 사용하여 분리.

13. Figure 5. Size exclusion chromatography.

14. Affinity chromatography • 원리. - 가장 최근에 발전되었으며, 가장 선택적인 방법. - 특정의 생체고분자에 친화성 있는 물질을 불용성의 담체에 화학적으로 결합시켜 고정상으로 하고 이것에 생체고분자 혼합물의 용액을 흐르게 하여 고정상에 친화력 있는 것과 없는 것으로 분리. - 예를 들면 천 종류의 단백질을 포함한 혼합물이 컬럼을 통과할 때, 단지 항체와 반응하는 하나의 단백질만 컬럼에 결합된다. • 사용되는 지지체. - 물리, 화학적으로 안정하고 견고한 유기물 또는 무기물의 고분자 수지. - 사용되는 예로써는 젤, 유리구슬, 나일론 섬유등이 대표적인 물질.

15. Figure 6. Affinity chromatography.

16. Theory • LC의 기본원리. - 고정상은 다공성 고체 분말이 길고 작은 튜브에 충진 되어 있고, 투입된 소량의 용액을 컬럼에 주입하면각 성분은 충진물에 흡착과 탈착이 연속적 으로 이루어지면서 충진물과의 친화력의 차이만큼 각각 이동속도가 차이가 생겨 분리. • 분배계수(Partition coefficient). - 각 성분 X는 컬럼을 통과하면서 고정상(s,충진물)과 이동상(m)사이에 분배 가 이루어지고, 분배가 어느 정도가 어느 쪽으로 치우쳤는지를 분배 계수로 나타 낼 수도 있다. [X]s : 고정상에 분배된 시료의 농도.[X]m : 이동상에 분배된 시료의 농도.K : 분배 계수.

17. Figure 7. Procedure of separation for a three component mixture. 검출기 검출기 C component B component A component

18. Figure 8. A typical chromatogram for a three component mixture. tM: 이동상이 칼럼을 빠져 나오는데 걸리는 시간trB : 용질 B가 컬럼을 빠져 나오는데 걸리는 시간twB: 용질 B 피크의 폭, h : 피크높이

19. Theory • 용량인자(Capacity factor). - 각 성분이 컬럼에서의 머무는 정도를 나타내는 척도로 용질이 고정상과 이 동상에 각 각 머무르는 시간의 비를 말함. - 한 성분이 칼럼에 오래 머물수록 Capacity factor k 는 커지고, 용량인자가 커질수록 분리가 잘 되지만, 띠폭이 넓어짐. tM : 이동상의 머무름 시간trB : 시료 B의 머무는 시간 -K = 0 : 시료가 칼럼에 전혀 머무르지 않고 tM에 용출됨. K = 1 : 시료가 tM의 2배가 되는 곳에서 용출됨. 1< K <6 : 시료가 적합하게 용출됨.

20. Theory • 단 이론- 단 이론이란 컬럼내에 단(theorecal plate)가 연속적으로 연결 되어 있고, 분배 평형이 일어나 물질이 분리되는 것을 말한다. - 컬럼의 분리 능력을 지칭하는 하는 컬럼 효율은 단 이론으로 설명된다. - 이론 단수가 많을 수록 컬럼 효율이 높고, 단 수가 높을 수록 효율은 낮다. • 컬럼 효율을 증가시키는 방법.- 칼럼 충진물의 크기가 작을수록 증가 : 작은 입자 일 수록 높은 흐름속도를 허용하고, 작은 입자와의 평형은 보다 빠르기 때문에 정지상 입자가 작을 수 록 더 많은 이론단수를 준다.- 이동상의 점도가 감소할수록, 온도가 높아 짐에 따라.- 용질의 크기가 작을 수록.

21. Figure 9. Calculation of a theoretical plate. 여기서 L : 컬럼의 길이, N : 이론단수, HETP : 단 이론 높이(the Height equivalent to a theoretical plate).

22. Theory • 분리도(Resolution). - 상호간의 서로 다른 두 봉우리의 분리도는 다음과 같이 정의 될 수 있다. - 시료의 분리상태를 표시하는 지표로서 Capacity factor, Selectivity, 이론단 수 등과 관련이 있고, 관계는 다음과 같이 표시 할 수 있다. - 여기서  는 selectivity, k2는 머무름이 더 긴 두번 째 인자의 capacity factor 이고, kave는 두 성분의 capacity factor.

23. Figure 10. Column resolution of chromatographic separation.

24. Figure 11. Separation of a three component mixture with gradient elution.

25. Figure 12. A criterion of choice of HPLC method. Cyano, amino Silica Cyano, amino, diol 분자량 >2000 물에 용해 유기용매에 용해 비극성 –약한극 용매에 용해(hexane에서 CHCl3) 비이온성 또는이온쌍 약한 극성 용매 –극성 용매에 용해(CHCl3에서 CH3OH) 이온성 Bondednormal-phasechromatography Bondedreverse-phasechromatography CHCl3에 용해 Alcohol, acetonirile , ethyl acetate에 용해 Adsorptionchromatography Bondednormal-phasechromatography C18, C8, C2,C1, phenyl, cyano Ion-exchange orion chromatography

26. Figure 13. A criterion of choice of method. Molecular exclusionchromatography Ion-exchange chroamtography C18, C8, C4or Phenyl or poly-ether resin 분자량 < 2000 물에 용해 유기용매에 용해 비이온성 또는 이온쌍 이온성 분자크기< 30 nm 분자크기30 nm – 400 nm 분자크기30 nm – 400 nm 분자크기< 30 nm Bondedreverse-phasechromatography Bondedreverse-phasechromatography Molecular exclusionchromatography C18, C8, C4

27. Liquid chromatography • LC의 응용. -비휘발성 물질, 열에 약한 물질 등의 분리 및 분석에 이용.- 분리된 성분의 정량,정성 분석에 응용. - 혼합물에서 순수한 물질을 분리 할 경우. • HPLC 시스템 구성. - HPLC system은 이동상(solvent) 저장용기와 기체제거장치(degasser), 펌 프(pump), 고정상 (column), 시료주입장치(injector), 검출기(detector), 기 록기(recorder)의 기본 장치들로 구성. - HPLC system에서는 고정상(column내 충진제)의 입자의 크기를10 ㎛ 이 하의 것을 사용하므로 이동상(solvent)가 흐를 수 있도록 수십 기압의 압력 을 가하여 물질의 분리할 수 있게 해주는 장치.

28. Mobile phase • HPLC에 사용되는 용매가 갖추어야 할 조건. - 점도가 낮아야 하고, 이동상이 고정상을 녹여서는 안된다. - HPLC grade의 용매 이어야 한다. - 분리하고자 하는 시료는 반드시 이동상에 녹아야 하고, 이동상 용매는 시 료에 대해 일정한 조건을 유지해야 한다. - 극성 물질이나, HPLC 칼럼에서 이온화 될 수 있는 물질을 분리하고자 할 때 에는 보통 buffer 용매를 사용한다. • 등용매 분리(isocratic elution)와 기울기 용리(gradient elution). - 등용매 분리 : 이동상으로 한가지 용매만 흘려 주는 것. - 기울기 용리 :용매의 조성을 계속적으로 바꾸어 주는 방법.

29. Pump • 펌프가 갖추어야 할 조건. - 안정하고 재현성 있는 흐름. - 펌프 내부는 용매와의 화학적 상호 반응이 없어야 한다. - 일정한 압력과 유속으로 용매를 밀어 줄 것. - 경제성이 있어야 하고, 재현성 있는 retention time을 얻을 수 있어야 한다. - 펌프에서 나오는 용매의 공급은 펄스가 없어야 한다. • Reciprocating 펌프의 작동원리. - 피스톤이 뒤로 움직이면 inlet ball check valve가 열려 펌프의 작은 공간에 용매가 펌핑되고 피스톤이 다시 앞쪽으로 나오면 outlet check valve가 열 려 펌핑된 용매를 컬럼에 흘려 보낸다.

30. Figure 14. The configuration of pump.

31. Injector • 시료 주입 장치(Injector). - 밸브에 일정 부피를 갖는 loop를 달아 시료의 양을 정확히 주입. - Injector를 load위치에 놓고 주사기를 밀어 넣어 시료를 load하면 시료는injector의 loop안에 남고 이동상은 펌프에서 컬럼으로 loop를 거치지 않고 흐르나 injector를 inject위치로 돌리면 이동상이 loop를 지나면서 시료와 섞 여 시료를 컬럼으로 운반한다.

32. Figure 15. The configuration of injector.

33. Packed materials • Large porous. - 충진 입자의 크기가 50 ~ 250 m 정도의 다공성 실리카 겔을 사용. - 컬럼내 걸리는 압력은 0.1 ~1 atm정도 이고, 이동상의 유속은 약0.1mL / min으로 낮아 분석 시간이 오래 걸림. - 정지상의 표면적이 넓어 한번에 분리 할 수 있는 시료의 양이 많다. • Pellicular. - 지름 40 m 정도의 단단하고 porous하지 않은 유리 구슬 위에 1~3 m 두 께로 실리카젤, 수지, 폴리 아미드 등의 다공성 물질을 입힌 충진제. - 충진물의 크기가 작아 짐에 따라 컬럼의 효율이 좋아 졌으나 압력이 많이 걸 려 펌프의 사용이 대두되고, HPLC가 등장. - 표면적이 적어짐에 따라 분리할 수 있는 시료양이 적다. • Porous microparticle. - 5 ~ 10 m크기의 다공성 입자로서, 입자 크기가 작기 때문에 컬럼 효율이 높고 다공성으로 표면적이 넓어 분리 할 수 있는 시료 용량이 크다. - 크기가 큰 다공성 입자 보다 가격이 비싸고 충진 하기가 어려운 단점.

34. Figure 16. The configuration of packed materials. (a)Large porous (b) pellicular (c) Porous microparticle (a) (b) (c)

35. Figure 17-1. The configuration of inside HPLC column. Mobile Phase Stationary Phase Column Packed material

36. Wall of column Figure 17-2. Types of open capillary column. Flow I.D 100 ~ 700m Stationary phase Solid support (a) Wall coated open tube (b) Support coated open tube (c) Porous layer open tube

37. Column • 분석용 칼럼(Analytical column). - 실제로 많이 쓰이는 컬럼은 길이 25Cm, 내경 4.6mm, 충진제의 크기 5 m,이론단수 400, 000 ~ 60, 000 plate/m. - 최근에는 분리 속도와 분리능이 훨씬 좋은 Micro LC를 위한 내경 1~ 4.6 mm, 길이가 3~7.5cm, 충진제의 크기가 3~5 m인 칼럼이 사용. • 보호칼럼(Guard column). - 칼럼의 오염을 줄이거나 수명을 연장시키기 위하여 사용되고, 보호 칼럼을injection system과 analytical column사이에 설치한다. - 정지상에 비가역적으로 흡착된 용매와 시료안에 있는 불순물은 보호 컬럼 안에 남에 있게 되고, 주기적으로 버린다. - 길이가 5~10cm 정도로 짧으며 pellicular 충진제로 이루어져 있다.

38. UV-Vis detector • 원리. - 광원에서 특정 파장의 빛이 광로를 거쳐 검출기 셀 내의 시료에 투입되면 특정 파장의 빛이 시료에 흡수. - 검출기에 얼마 만큼 빛이 흡수 되었는가를 전기적인 신호로 나타내고 이 신호의 크기를 이용하여 시료의 정량 분석이 이루어짐. • 사용 범위. - 많은 용질들이 자외선을 흡수 하고, 검출기의 감도가 상당히 높기 때문에 HPLC 검출기로 가장 많이 사용되고 있음. - 사용이 간편하고, baseline 안정화 시간이 짧고 파장 선택 조절이 가능. - 흡수가 없는 용매를 사용한 기울기 용리(gradient elution)에 적합.

39. Refractive index detector • 원리. - Reference cell과 sample cell에 포함된 시료와 용매의 굴절률 차이가 존재하게 되고, 비임이 광전관 중심으로부터 deflect 되고 검출기의 신호가 변한다. - 자외선 검출기 보다 감도 약 1000배 낮고, 검출기가 이동상의 조성에도 영향을 받기 때문에 기울기 용리에는 사용되지 않음. - 압력과 온도 변화에 민감하여 흐름 속도가 일정해야 하며, 온도 변화도 0.01 oC이 내로 일정해야 한다. • 사용 범위. - 굴절률에 의하여 분석하므로 거의 모든 물질에 사용할 수 있으나, 감도가 낮기 때문에 미량 분석에는 사용되지 않고, 자외선 흡수가 없는 거의 없는 탄수화물과 지방족 중합체와 같은 물질에 일반적으로 적용.

40. Electrochemical detector • 원리. - 분석 물질이 쉽게 산화 되거나 환원되어야 하므로 약간 선택적. - 예를 들어 페놀, 방향족 아민 과산화물, 머캅탄은 산화에 의해 검출되고, 케톤, 알데히드, 방향족 할로겐은 환원에 의해 검출. • 특징. - 검출될 수 있는 분석 물질에 대해서는 아주 감도가 높고, 검출 한계가 나노 암페어 까지 측정할 수 있다. - 전해질이 녹아 있는 수용액이나 다른 극성 용매가 필요하며, 이것은 산소 가 전혀 없어야 한다. - 이 검출기는 흐름 속도와 온도 변화에 민감.

41. Fluorescencedetector • 원리. - 시료에서 발광하는 형광의 세기는 시료의 양(농도)에 비례하는 원리. - 시료가 형광을 방출 할 때 혹은 시료를 형광을 낼 수 있는 화학기를 원하 는 분석 물질에 붙여서 형광 유도체로 만들었을 때 사용. - 감도가 아주 좋지만, 오직 형광을 내는 제한된 범위의 분석 물질에 대해 서만 사용 가능. • 사용 범위. - Uv detector보다 100 ~ 1000 배 정도 선택성이 좋다. - 생화학, 의학, 공중보건, 약리학, 석유 화학 분야. - Polycylic armatic, Aflatoxin류, Amino acid류.

42. Troubleshooting(Pressure) • 원인. - Frit 막힘. - 컬럼 오염. - 충진물 막힘. • 압력이 높은 경우 조치 사항. - 컬럼 세척 : 컬럼 오염 물질과 막힌 입자 제거, 고분자 물질과 흡착제 제거,시료나 버퍼 침전물 제거. - 역방향 세척 : Frit 막힘 해결. - Frit 교체 : Frit 막힘 해결. • 압력 증가를 막는 방법. - 컬럼 보호 장치 사용(Guard column). - 시료 여과. - 적절한 컬럼 세척. - 이동상 여과.

43. Troubleshooting(Peak split) • 현상. - 한 개의 피크임에도 불구하고 두 개의 성분이 같이 용리된 것 처럼 나타남. • 원인. - 컬럼 오염 - 주입 용매에 의한 영향 : 이동상 보다 강한 용매를 주입하면 피크 쪼개짐 이나 띠 넓어짐(Broadening) 등의 피크 모양의 문제가 생길 수 있다. - 컬럼 앞 부분이 부분적으로 막힘. • 피크 쪼개짐 원인 제거. - 매트릭스가 복잡한 시료 분석 후 또는 많은 양의 시료 분석 후 : 컬럼 오염 또는 frit 막힘. - 이동상 pH>7 : 실리카 용해에 의해 컬럼에 불감 부위(Void)생성 하는데,특수 컬럼 사용으로 방지 가능하다. - 시료 용해 용액이 이동상 보다 강한 경우 : 피크의 쪼개짐과 확산.

44. Troubleshooting(Peak tailing) • 원인. - 2차 머무름 효과- 컬럼 불감 부피(void volume). - 컬럼 오염. - 컬럼 노화. • 피크 쪼개짐 원인 제거. - 이동상 효과 검토 : 이동상 pH와 첨가제 추가로 2차 효과 제거. - 칼럼 선택 검토 : 초순수 실리카 컬럼 또는 작용기 결합 방법이 다른 컬럼 선택. - 시료 주입량 감량. - 컬럼 세척과 컬럼 불감 부피, 노화 확인.

45. Troubleshooting(Retention time) • 원인 - 컬럼 노화. - 컬럼 오염. • - 컬럼과 이동상의 부적절한 조화. - 이동상, 유속 변경. • 머무름 시간 변동시(컬럼간)- 측정할 피크의 capacity factor, selectivity,tr 결정. - 컬럼 세척. - 새컬럼 테스트- lot number 확인. - 매분석시 새로 만든 이동상 사용. • 머무름 시간 변동시(로트간)- 컬럼 사용 정도의 차이(노화). - 불충분한 컬럼 평형. - 컬럼과 이동상의 부적절한 조화. - 이동상, 유속 변경.

46. Eluotropic series • 정의. - 주어진 흡착제로 부터 용질을 치환시킬 수 있는 용액의 상대적 능력의 세기 를 비교한 것이다. - 용리액 세기(eluent strength, o )는 용매의 흡착 에너지의 척도 인데, 펜탄 의 값을 0으로 정한다. - 일반적으로 용리액의 세기가 클수록 용질은 더 빨리 컬럼으로 부터 용리됨. • 과정. - 처음에는 약하게 머무르는 용질이 약한 용리액 세기를 갖는 용매에 의해 용리 된다.- 두번째 용매를 첫번째 용매와 섞어 불연속적, 또는 연속적인 단계로 용리액 세기를 증가 시키고 이러한 과정으로 매우 강하게 흡착된 용질이 컬럼으로 부터 용리된다.

47. Table 1. Eluotropic series. Solvent Fluoroalkanesn-Pentanei-Octanen-Heptanen-DecaneCyclohexaneCyclopentane Carbon disulfideCarbon tetrachloride1-Chloropentanei-Propyl chlorideToluene1-ChloropropaneChlrobenzene BenzeneBromoethaneDiethyl etherChlroform Solvent DichlromethaneTetrahydrofuran1,2-Dichloromethane2-ButanoneAcetoneDioxaneEthyl acetate Methyl acetate1-PentanolDimethyl sulfoxideAnilineNitromethaneAcetonitrilePyridine 2-PropanolEthanolMethanol1,2 Ethanediol

48. Practical analytical method development • 컬럼선택. - 역상 컬럼의 종류는 Methyl, butyl, octyl, octadecylsilane, phenyl, amine, cyano column 등이 있고, 실리카에 결합된 alkyl silane 작용기를 가지고 있어, retention time, component elution을 변화 시킴. - 컬럼을 선택 할 때는 octadecylsilane로 시작하여 retention time 이 너무 길 으나 분리도가 우수 할 경우에는 chain이 더 짧은 otyl silane column을 사 용한다. - 컬럼 길이를 선택함은 resolution, 피크모양, 재현성을 잃지 않고 retention time을 줄일 수 있는 방법. • 이동상의 선택. - 역상 HPLC의 이동상은 물과 CH3CN, CH3OH, Tetrahydrofuran(THF)과 같 은 organic modifier의 혼합물로 구성. - 비극성인 target인 경우에는 물과 하나 또는 그 이상의 organic modifier의 혼합물로 분리가 수행됨.

49. Practical analytical method development THF MEOH ACN